Soft litografi ile array platformlarının hazırlanması ve uygulamaları

Abstract

Sunulan çalışmanın amacı, proteinlerin ve oligonükleotidlerin tanısında kullanılmak üzere istenilen desendeki array platformlarının `soft litografi' tekniklerinden biri olan mikro-temas (µCP) baskılama yöntemi ile oluşturulması ve oluşturulan bu array platformlarının performanslarının ölçülmesidir. Tez çalışması üç ana grupta toplanmıştır. İlk bölümde, array platformlarının oluşturulması için kullanılacak Polidimetilsiloksan (PDMS) esaslı baskılar elde edilmiştir. Baskı kalitesinin istenilen şekilde olması için PDMS baskıların hazırlanma koşulları optimizasyonunda, baskıların sertlikleri de göz önünde bulundurularak, optimum koşulların 100 °C'de 1 saat olduğu bulunmuştur. İkinci bölümde, array platformlarını oluşturmak için kullanılacak cam slaytlar öngörülen süreçler uygulanarak temizlenmiş ve altın kaplanmıştır. DNA ve protein array platformları için prob molekül olarak sırasıyla M. Tuberculosis (MTB) ve İnsan Serum Albümini (HSA) kullanılmıştır. Altın kaplanan cam slaytlara, pH 3.8'te 5 µM'lık M. tuberculosis Kompleks'ine (MTB) özgü prob oligonükleotid (5'?HS-(CH2)6?(T)15 GGG TGC ATG ACA ACA AAG TTG G?3') mikro-temas baskılama (µCP) yöntemi ile hazırlanan PDMS baskılar kullanılarak baskılanmış ve MTB prob oligonükleotid array platformları oluşturulmuştur. Elipsometre ile oluşturulan MTB prob oligonükleotid spotlarının kalınlık değerleri ortalama 2.765 nm olarak ölçülmüş ve bu değerin teorik moleküler uzunlukla uyumlu olduğu görülmüştür. İnsan Serum Albümin (HSA) array platformlarını oluşturmak için ise önce altın kaplı cam slaytlara PDMS baskı ile Merkaptoundekanoikasit (MUA) µCP yöntemi ile baskılanmış ve MUA'nın yüzeyde kendiliğinden düzenlenen tek tabakaları oluşturması için baskılama koşulları optimize edilerek baskılama konsantrasyonu, mürekkepleme süresi ve baskılama süresi sırasıyla 5 mM, 5 dakika ve 30 saniye olarak belirlenmiştir. Daha sonra karbodiimid reaksiyonu ile MUA baskılanmış bölgelere (`spot') kimyasal olarak HSA bağlanmıştır. Yüzey Plazmon Rezonans cihazı kullanılarak farklı derişimlerde (5-500 nM) elde edilen HSA'nın bağlanma kinetikleri ve elipsometre ile yapılan kalınlık ölçümleri göz önünde bulundurularak HSA immobilizasyonu için optimum derişim 10 nM olarak belirlenmiştir. Hazırlanan MTB prob oligonükleotid ve HSA array platformlarının yüzey analizleri Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaşma (`MALDI') cihazı ile yapılmıştır. Yüzey analizlerinin optimizasyonu için MALDI MS'de HSA ve MTB prob oligonükleotidinin çözeltideki analizleri yapılmış ve optimum şiddetteki pikler elde edilmiştir. Aynı zamanda yüzeyde oluşturulan kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar (SAM) sayesinde HSA ve MTB prob oligonükleotidinin daha düşük derişimlerde tayin edildiği de gösterilmiştir.Üçüncü bölümde, MTB prob oligonükleotid spotlarına farklı derişimlerde MTB hedef oligonükleotidlerin hibridizasyonu ve HSA spotlarına farklı derişimlerde İnsan Serum Albümin Antikoru (anti-HSA antikoru)'nun etkileşimleri SPR ile incelenerek, oluşturulan array platformlarının performansları belirlenmiştir. Elde edilen bağlanma kinetikleri ve yapılan kalınlık ölçümleri doğrultusunda MTB hedef oligonükleotidinin hibridizasyon ve anti-HSA antikorunun etkileşim derişimleri sırasıyla 1 µM ve 10 nM olarak optimize edilmiştir. Optimizasyonlar sonrasında array platformalarının yüzey analizleri MALDI MS cihazı ile yapılmıştır. Yüzey analizlerinin optimizasyonu, MALDI MS cihazında anti-HSA ve MTB hedef oligonükleotidinin çözeltideki analizleri ile gerçekleştirilmiş ve optimum şiddetteki pikler elde edilmiştir. Aynı zamanda yüzeyde oluşturulan SAM'ler sayesinde MTB hedef oligonükleotidinin daha düşük derişimlerde tayin edildiği de gösterilmiştir.

The aim of the presented thesis is preparation of array platforms with desired patterns by using one of soft lithographic techniques `micro-contact printing? (µCP), that is used for the detection of proteins and oligonucleotides and performance measurement of these array platforms. Thesis consists of three main parts. In the first part, polydimethylsiloxane (PDMS) based stamps that would be used in preparation of array platforms were fabricated. The fabrication conditions of PDMS stamps were optimized by considering the hardness of the stamps as 100°C and 1 hour in order to have desired printing quality. In the second part of the thesis, the glass slides that would be used as substrates for array platforms were cleaned and gold coated belong to the mentioned procedures. M. Tuberculosis (MTB) and Human Serum Albumin (HSA) are the probe molecules that were used for DNA and protein array platforms, respectively. The MTB probe oligonucleotide array platforms were prepared by using micro-contact printing method that prints 5 µM M. tuberculosis Complex (MTB) probe oligonucleotide (5??HS-(CH2)6?(T)15 GGG TGC ATG ACA ACA AAG TTG G?3?) solution at pH 3.8 with PDMS stamps on gold coated glass slides. The average thickness values of the MTB prob oligonucleotide spots were measured as 2.78 by using ellipsometer and it is seen that this value is compatible with the theoretical values. In order to obtain HSA array platforms first Mercaptoundecanoicacid (MUA) was printed on gold coated glass slides by µCP method, then optimizing of printing concentration, duration of inking and printing were determined as 5 mM, 5 minutes and 30 seconds, respectively in order to obtain self-assembled monolayer formation of MUA. Later, HSA was chemically bonded to MUA printed regions (`spot?) by carbodiimide reaction. According to the binding kinetics that were measured by Surface Plasmon Resonance device and thickness values that were measured by ellipsometer of HSA at different concentrations, the optimum immobilization concentration of HSA was determined as 10nM. The surface analysis of MTB prob oligonucleotide and HSA array platforms were done by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization(`MALDI?). For the optimization of surface analysis, first HSA and MTB probe oligonucleotides were analyzed in solution phase and pikes at optimum intensity were obtained. Furthermore, it has been proved that HSA and MTB probe oligonucleotides can be defined at low concentrations by the formation SAMs on surfaces.In the third part, by examining the hybridization of MTB target oligonucleotides with MTB probe oligonucleotide spots and interaction anti-HSA antibodies with HSA spots at different concentrations with SPR, array platform performances were determined. According to obtained binding kinetics and ellipsometric thickness values, hybridization concentration of MTB target oligonucleotide and interaction concentration of anti-HSA antibody were optimized as 1 µM and 10 nM respectively. After the optimizations surface analysis of the array platforms were done by using MALDI MS. The optimization of surface analysis was made with the analysis of HSA and MTB probe oligonucleotides in solution phase and pikes at optimum intensity were obtained. Furthermore, it has been showed that MTB target oligonucleotides can be defined at low concentrations by the formation SAMs on surfaces.