Denizel kökenli mikrobiyal suşlardan arginin deiminaz terapötik enziminin üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Enzimlerin yüksek afinitede, özgül olarak hedeflerine bağlanarak katalitik aktivite göstermeleri onları terapötik amaçlı kullanım için güçlü bir alternatif haline getirmektedir. Günümüzde proses optimizasyonu ile kısa sürede yüksek verimli ve maliyet etkin enzim üretiminde mikroorganizmalar yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca mikrobiyal dünyanın geniş biyoçeşitliliği nedeniyle farklı niteliklerde enzimlerin keşfinde mikroorganizmalar önemli bir kaynak olarak önemini korumaktadır. Bu tez çalışmasında, denizel kökenli mikroorganizmaların (aktinomiset, bakteri ve fungus izolatları) arginin deiminaz (ADI) aktivitesi için taranması, aday üreticilerin proteinaz K dirençlerinin belirlenmesi ve seçilen izolata ait ADI'nin saflaştırılarak kısmi karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda; ilk aşamada, 101 bakteri, 106 aktinomiset ve 94 fungus olmak üzere toplam 301 adet denizel kökenli mikroorganizma arginin deiminaz aktivitesi açısından taranmış ve seçilen iyi üreticiler (6.12.8a, 6.12.16, 6SM134, 6SM150, MF87 ve MF94) ile küçük ölçek fermantasyon çalışmalarına geçilmiştir. Ardından hücre içi ve hücre dışı ADI aktiviteleri ve proteinaz K direnç özellikleri incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; 6SM134 kodlu aktinomiset izolatının, ADI üretimini hem hücre içi hem de hücre dışı ürettiği görülmesine karşın, üretilen hücre dışı enzimin proteinaz K'ya direnci oldukça yüksek olduğundan, ileri çalışmalara bu izolat aracılığıyla üretilen hücre dışı ADI ile geçilmiştir. Küçük ölçek fermantasyon çalışmalarıyla üretilen enzimin saflaştırılmasında sırasıyla; %70 amonyum sülfat çöktürme, diyaliz, iyon değişim kromatografisi (DEAE-Selüloz) basamakları uygulanmıştır. Enzim, iyon değişim kromatografi kolonundan elüsyon sonucu %57 verimlilik ile 585 kat saflaştırılarak; 53 kDa boyutunda iki alt birimden oluşan 105 kDa'luk bir dimer olduğu belirlenmiştir. Kısmi karakterizasyon çalışmaları ile ADI'nin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH değeri 35°C, ve pH 6,8-7,4 olarak belirlenmiştir. Enzimin termal kararlılığının yüksek olduğu; 70C'de yarım saat bekletildikten sonra aktivitesini %68 oranında, 50 C'de ise aktivitesini yaklaşık %82 oranında koruduğu belirlenmiştir. pH kararlılığı çalışması sonucunda ise ADI'nin nötr pH değerlerinde kararlı olduğu görülmektedir. 16S rDNA dizi analizi ile izolatın Streptomyces mutabilis olduğu belirlenmiştir.

Enzymes show catalytic activity with high affinity, specifically binding to their targets, making them a powerful alternative for therapeutic use. Nowadays, microorganisms are widely used in the production of high-efficiency and cost-effective enzymes in a short time with process optimization. In addition, due to the wide biodiversity of the microbial world, microorganisms maintain their importance as an important source in the discovery of enzymes with different qualities.In the thesis study, it was aimed to screen the marine microorganisms (actinomycetes, bacteria and fungus isolates) for arginine deiminase activity, to determine the proteinase K resistance of the candidate producers and to purify and partially characterize the arginine deiminase of the selected isolate. In this context, in the first stage, a total of 301 marine-derived microorganisms, 101 bacteria, 106 actinomycetes and 94 fungi, were screened for arginine deiminase activity and small-scale fermentation studies were started with selected producers (6.12.8a, 6.12.16, 6SM134, 6SM150, MF87 and MF94). Then, intracellular and extracellular arginine deiminase activities and proteinase K resistance properties were investigated. According to the results, further studies were started with the actinomycetes isolate (6SM134) which is producer of the arginine deiminase both intracellularly and extracellularly. This isolate has been chosen since power of resistance to proteinase K and giving quite high activity. Arginine deiminase was produced by small-scale fermentation and in its purification, respectively; 70% ammonium sulfate precipitation, dialysis, ion exchange chromatography (DEAE-Celulose) processes were applied. The enzyme was purified 585 times with 57% efficiency after elution from the ion exchange chromatography column and the enzyme was determined to be a 105 kDa dimer consisting of two 53 kDa subunits. With partial characterization studies, the optimum temperature and pH value of uricase were determined as 35°C and pH 6.8-7.4. It was determined that the thermal stability of the enzyme was high, since it was observed that it preserved its activity by 68% after half an hour at 70oC and approximately 82% at 50oC. As a result of pH stability study, it is seen that arginine deiminase is stable at neutral pH values. The isolate was identified as Streptomyces mutabilis by 16S rDNA sequencing.