İmplante edilebilir biyomalzemelere karşı oluşan bağışıklık yanıtının belirlenmesi için in vitro üç boyutlu model geliştirilmesi

Abstract

İmplantasyon sonrasında hastanın vücudunda biyomalzemeye karşı oluşan bağışıklık yanıtı, yanıtın şiddetine bağlı olarak implante edilebilir biyomalzemelerin fonksiyonel ömürlerinin kısalmasına, hasta için pahalı ve uzun süreli tedavi ihtiyacına, morbiditeye neden olabilmektedir. İn vivo enflamatuvar durumun karmaşıklığını en iyi şekilde taklit edebilecek 3B in vitro model geliştirilerek; M1/M2 makrofaj oranının (CD80/CD206 belirteçleriyle), pro-enflamatuvar ve anti-enflamatuvar sitokin (IL-6, IL-10) miktarlarının belirlenmesiyle, hidrojellere karşı oluşan bağışıklık yanıtının klinik kullanımdan önce belirlenmesi sağlanmıştır. Takip edilen 13. gün sonunda PAAm-Alg hidrojeline karşı oluşan M1/M2 oranı 0.73 iken XLS eklentisi ile 0.85'e ulaşılarak hafif M2 ağırlıklı dengeli, biyouyumlu olmayan grafit eklentisi ile ise 2.64'e ulaşılarak M1 ağırlıklı bir sonuç elde edilmiştir. PAAm-Alg ve XLS/Alg-PAAm hidrojellerinin M2 polarizasyonunu teşvik eden TGF-β3 ile yüklenmesi M1/M2 oranlarının sırasıyla 0.87 ve 0.88'e ulaşarak daha dengeli olmasını sağlamıştır. 13. gün sonunda PAAm-Alg ve XLS/Alg-PAAm hidrojellerine karşı salgılanan IL-6 (4.587382±0.042, 5.806631±0.03 pg/ml) azalırken IL-10'un (120.7318±0.36, 107.2094±0,06 pg/ml) artması da proenflamatuvar yanıttan antienflamatuvar yanıta geçildiğini doğrulamaktadır. Bu sonuçlar, MTT testinde PAAm-Alg ve XLS/Alg-PAAm ile hücre canlılığı %70'in üstündeyken PAAm-Alg-G'nin canlılığı %70'in altına düşürmesi ile uyumludur. DNA hasarının bir ölçütü olan olive kuyruk momenti sonuçlarında da ATDC5, L929, Raw264.7 hücreleri için sırasıyla PAAm-Alg (2.8948±1.989723, 4.381304±2.76885, 2.93525±1.019861) ve XLS/Alg-PAAm (3.472394±2.463333, 5.685884±2.699729, 4.595±2.73966) sonuçları pozitif kontrole göre anlamlı olarak farklı bulunmazken PAAm-Alg-G sonuçları (16.36933±9.26993, 14.11381±6.69354, 8.878307±2.187607) anlamlı olarak farklı bulunmuştur. PAAm-Alg ve XLS/Alg-PAAm hidrojellerinin toksik etkisinin olmadığı fakat PAAm-Alg-G hidrojelinin toksik etki göstererek bağışıklık yanıtı sonuçlarında da görüldüğü gibi proenflamatuvar bir çevre oluşturarak implantasyon için uygun olmadığı ortaya konulmuştur. XLS/Alg-PAAm ve PAAm-Alg hidrojellerine karşı oluşan bağışıklık yanıtının iyileşmeyi teşvik edecek şekilde geliştiği gösterilmiştir, bu biyomalzemeler in vivo çalışmalarda kullanım için umut vaat etmektedir. Hayvan deneylerine alternatif 3B in vitro model geliştirilerek biyomalzemelerin klinik öncesi testler ile bağışıklık yanıtlarının öngörülmesi; para ve zaman kaybının azaltılması, etik sorunların üstesinden gelinmesi ve tedavi başarısının arttırılması gibi çeşitli avantajlar sağlayacaktır.

The immune response to the biomaterial in the patient's body after implantation may shorten the functional life of the implantable biomaterials depending on the degree of the response. By developing a 3D in vitro model, the M1/M2 macrophage ratio, pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine amounts were determined to evaluate the immune response to hydrogels before clinical use. 13th day, the M1/M2 ratio against the PAAm-Alg hydrogel was 0.73, while the ratio of 0.85 was achieved with the XLS add-on, resulting in a balanced result with slight M2 dominance. A result of M1 dominance was obtained by reaching the ratio of 2.64 with the non-biocompatible graphite addition. 13th day, while the IL-6 concentrations (4.587382±0.042, 5.806631±0.03) secreted against the PAAm-Alg and XLS/Alg-PAAm hydrogels decreased, the increase in IL-10 concentrations (120.7318±0.36, 107.2094±0.06 pg/ml) confirmed that the pro-inflammatory response was switched to the anti-inflammatory response. In the results of the olive tail moment, which is a measure of DNA damage, PAAm-Alg (2.8948±1.989723, 4.381304±2.76885, 2.93525±1.019861) and XLS/Alg-PAAm (3.472394±2.463333, 5.685884±2.699729, 4.595±2.73966) results for ATDC5, L929, Raw264.7 cells, respectively, were not found to be significantly different compared to the positive control, but PAAm-Alg-G (16.36933±9.26993, 14.11381±6.69354, 8.878307±2.187607) results were found to be significantly different. It has been demonstrated that the PAAm-Alg and XLS/Alg-PAAm hydrogels do not have a toxic effect, but the PAAm-Alg-G hydrogel has a toxic effect and is not suitable for implantation by creating a proinflammatory environment. The immune response to XLS/Alg-PAAm and PAAm-Alg hydrogels has been shown to develop in a way that promotes healing, these biomaterials are promising for use in in vivo studies. Predicting immune responses by developing an alternative 3D in vitro model to animal experiments; It will provide various advantages such as reducing the loss of money and time, overcoming ethical problems and increasing the success of treatment.