Rekombinant Pichia pastoris ile örümcek ipeği proteininden blok polimer üretimi

Abstract

Blok kopolimer, içindeki kovalent bağlarla bir araya gelmiş iki veya daha fazla sayıdaki farklı blokların, doğrusal bir düzenlemesinin bulunduğu moleküller içeren bir polimerdir. Blok kopolimerler yapılarındaki kimyasal bağlar sayesindeyüksek şeffaflık ve dengeli mekanik özellikler kazanmaktadır. Biyobozunur bloklar içeren blok kopolimerler, ilaç dağıtma sistemleri, doku mühendisliği, protez implantlar dahil birçok alandaki potansiyel uygulamaları ile dikkat çekmektedir.İpek, yapısında blok kopolimerler ve hidrofobik bloklar bulunduran doğal bir polimerdir. Örümcekler ve ipek böceklerince üretilen ipek polimerleri, kolay modifikasyon olanağına sahip, hidroksiapatit gibi kompozit materyallerle de uyumludur. Örümcek ipeği proteini Spidroinler, kemik dokusu yenilenmesi sürecinde kullanılabilecek mekanik özelliklere sahip olmalarına rağmen doğada üretilen miktarların az olması ve üretimdeki zorluklar, bakteriler, mayalar, transgenik bitki ve hayvanlar kullanılarak rekombinant üretim çalışmalarının yapılmasını sağlamıştır. Metilotropik maya P. pastoris, ucuz tanımlanmış ortamlardaki hızlı büyüme ile yüksek hücre yoğunluklarına ulaşma, hücre dışı protein salgılama yeteneği ve post-translasyonel modifikasyonlar ile doğru katlanan rekombinant ökaryotik proteinlerin üretimini sağlaması sayesinde popüler konak sistemlerinden biri haline gelmiştir. Tez çalışmasında, kemik iyileşmesine yardımcı apatit bağlama bölgesi dizisi ile zenginleştirilmiş spidroinin, üretimini gerçekleştirmek üzere gen aktarılan Pichia pastoris (X33) mayasının çalışmada 25, 27 ve 30 °C sıcaklık değerleri ve 4, 5.5 ve 7 pH değerlerinde 2 L biyoreaktör üretimleri gerçekleştirilmiştir. C1 suşunda 27 °C'de 7 pH değerinde 181.72 g/L; A2 suşunda 27 °C'de 5.5 pH değerinde 130 g/ L yaş hücre ağırlığına ulaşılmıştır. İlgili saflaştırma basamakları sonunda yapılan SDS-PAGE analizlerinde 36 kDa boyutundaki protein gözlemlenmiştir.

A block copolymer is polymer containing molecules in which there is a linear arrangement of two or more different blocks joined together by covalent bonds that give high transparency, stable mechanical properties. They containing biodegradable blocks have potential application fields including drug delivery systems, tissue engineering, prosthetic implants. Silk, natural polymer produced by spiders and silkworms, that contains block copolymers and hydrophobic blocks, compatible with composite materials such as hydroxyapatite, which have easy modification possibilities. Although spider silk protein, Spidroins, have mechanical properties that can be used for bone tissue regeneration, low natural production amounts and production difficulties have enabled recombinant production studies using bacteria, yeasts, transgenic plants and animals. The methylotropic yeast P. pastoris, is popular host system with its rapid growth in inexpensive defined media, reaching high cell densities, ability to secrete extracellular proteins, correctly folded recombinant eukaryotic protein production with post-translational modifications. In this thesis, 2 L bioreactors were produced with Pichia pastoris (X33) yeast, which was gene transferred to produce spidroin, which is enriched with apatite binding domain sequence that helps bone healing at 25, 27 and 30 °C temperature values and 4, 5.5 and 7 pH values. A wet cell weight of 181.72 g/L was reached in strain C1 at pH 7 at 27 °C, and 130 g/L at pH 5.5 30°C in strain A2. 36 kDa protein was observed in the SDS-PAGE analyzes performed at the end of the relevant purification steps.