Topraktan izole edilen bakteriler ile fibrinolitik enzim üretimi

Abstract

Amaç: Fibrinolitik enzimler fibrin pıhtılarını çözebilen trombolitik ajanlardır. Tıpta kullanılan streptokinaz, t-PA, ürokinaz ve fibrinolitik gibi trombolitik enzimler kardiyovasküler hastalıklar, felç, kalp krizi ve serebrovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında; farklı illerden alınan toprak örneklerinden proteaz ve fibrinolitik enzim aktivitesine sahip suş/suşların belirlenmesi; yüksek fibrinolitik aktivite gösteren izolat ile üretim besiyerinin optimizsayonu ve enzimin saflaştırılması amaçlanmıştır.Materyal ve Metot: Toprak örnekleri steril kaplarda laboratuvar ortamına getirilerek, seri dilüsyonları hazırlanmış, proteaz katı besiyerine yayma ekim yöntemiyle inoküle edilmiş ve 37°C'de 48-72 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Petrilerde gelişen mikroorganizmalardan bakteri suşları seçilerek, proteaz ve fibrinolitik enzim aktiviteleri incelenmiştir. Yüksek fibrinolitik aktiviteye sahip izolat alınmış ve 16S rRNA sekans analizi ile, tür düzeyinde tanılanmıştır. Ardından fibrinolitik enzim üretim ortamının optimizasyonu gerçekleştirilmiş, sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişim, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE ile protein büyüklüğü tespit edilmiştir.Bulgular: Bu tez çalışmasında; toprak örneklerinden proteaz aktivitesine sahip 60 adet izolat elde edilmiştir. Yapılan mikroskobik incelemeler sonucunda izolatların; 20 tanesinin küf/maya, 40 tanesinin ise bakterilere ait olduğu gözlemlenmiştir. En yüksek fibrinolitik enzim aktivitesine sahip izolatın V4 kodu ile Bacillus atrophaeus türüne ait olduğu tespit edilmiştir. Bu izolat kullanılarak fibrinolitik enzim üretimi için optimum Skim Milk Powder, pH, sıcaklık ve inkübasyon süresi sırasıyla; 15 g/l, 7, 35°C ve 72. saat olarak belirlenmiştir. B. atrophaeus'un ürettiği enzim saflaştırılarak, molekül kütlesi 36 kDa olarak belirlenmiştir.Sonuç: Mevcut çalışmada, fibrinolitik ve proteolitik enzimler arasında bağlantının olduğu, ancak yüksek proteaz aktivitesine sahip suşların her zaman yüksek fibrinolitik aktivite göstermediği tespit edilmiştir. Pek çok hastalığın tedavisinde rol alan ve maliyeti yüksek fibrinolitik enzimlerin ucuz, kolay erişilebilir bir kaynaktan da elde edilebileceği ortaya konulmuştur. Aynı zamanda enzim saflaştırması için iki kromotagrafik yöntemin de birlikte kullanılması gerektiği sonucuna varılmıştır.

Objective: Fibrinolytic enzymes are thrombolytic agents which can dissolve fibrin clots. Thrombolytic enzymes such as streptokinase, t-PA, urokinase and fibrinolytic utilised in medicine are used in the treatment of cardiovascular diseases, stroke, heart attack and cerebrovascular diseases. In this thesis study, it was aimed to identify the strain/strains with protease and fibrinolytic enzyme activity from soil samples taken from different provinces, to optimise the production medium for the isolate with high fibrinolytic activity and to purify the enzyme.Material and Method: Soil samples were brought to the laboratory in sterile containers, serial dilutions were prepared, they were inoculated on protease solid medium by spreading method and incubated at 37°C for 48-72 hours. Protease and fibrinolytic enzyme activities were investigated by selecting bacterial strains from microorganisms grown on petri dishes. The isolate with high fibrinolytic activity was taken and identified by 16S rRNA sequence analysis at species level. Then, the fibrinolytic enzyme production medium was optimized, purified by ammonium sulfate precipitation, ion exchange, gel filtration chromatography, respectively, and protein size was determined by SDS-PAGE. Results: In this thesis study, 60 isolates with protease activity were obtained from soil samples. As a result of the microscopic examinations, it was observed that 20 out of isolates belonged to fungus and 40 of them belonged to bacteria. It was determined that the isolate (V4 code) with the highest fibrinolytic enzyme activity belonged to Bacillus atrophaeus species. For fibrinolytic enzyme production using this isolate, optimum values for Skim Milk Powder, pH, temperature and incubation time were determined as 15 g/l, 7, 35°C and 72 hour, respectively. The enzyme produced by B. atrophaeus was purified and the molecular mass was determined as 36 kDa. Conclusion: In the current study, it was designated that there is an association between fibrinolytic and proteolytic enzymes, but strains with high protease activity do not always demonstrate high fibrinolytic activity. It was shown that costly fibrinolytic enzymes, which play a role in the treatment of many diseases, can also be obtained from inexpensive and easily accessible sources. At the same time, it was concluded that two chromatographic methods should be used together for enzyme purification.