Ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.) bitkisinde kadmiyum stresine cevapta etkili olan bazı genlerin ifade seviyelerinin ve DNA metilasyon oranlarının belirlenmesi

Abstract

Amaç: Son yıllarda kullanılan kimyasal gübreler, yanlış sulama teknikleri, değişen iklim koşulları gibi faktörler kadmiyum (Cd) ağır metalinin topraktaki birikimini artırmaktadır. Çalışmamızda önemli bir tarım ürünü olan ekmeklik buğdaya (Triticum aestivum L.) farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cd stresi sonrasında bitkide stres ile ilişkili olan genlerin ekspresyon seviyelerinin ve Real-Time PCR temelli kantitatif DNA metilasyon analizi (qAMP) ile ilk kez metilasyon seviyelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Yöntem: 0, 100, 250, 500 µM dozlarında Cd stresine maruz bırakılan buğday bitkisinin geliştirilmesi sağlanmış ve bu bitkilerden DNA ve RNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Elde edilen RNA örneklerinden cDNA sentezi yapılmış ve seçilen gen bölgelerine özgü primerler tasarlanarak üretilen cDNA'lar ile gen ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. DNA metilasyon oranları restriksiyon enzim temelli Real-Time PCR temelli kantitatif DNA metilasyon analizi tekniği uygulanarak belirlenmiştir ve elde edilen sonuçlar ile gen ekspresyon analizleri karşılaştırılmıştır.Bulgular: 0, 100, 250, 500 µM dozlarında uygulanan CdCl2 stresi altında, UGT-3, LTP-4 ve PIP-1 genlerinin gen ekspresyon seviyeleri ve DNA metilasyon yüzdeleri belirlenmiştir. UGT-3, LTP-4 ve PIP-1 geninde metilasyon yüzdesi hem gövdede hem de kökte en yüksek 250 µM konsantrasyonda belirlenmiştir. UGT-3 geninde ekspresyon seviyesi gövdede 250 µM konsantrasyonda en yüksek oranı verirken, LTP-4 geninde kökte 250 µM konsantrasyonda aşırı ekspresyon gerçekleşmiştir.Sonuç: UGT-3, LTP-4 ve PIP-1 genlerinin metilasyon oranlarındaki değişimler bitkilerde kullanımı yeni bir teknik olan qAMP ile ilk kez araştırılmıştır. Genlerin ekspresyon seviyeleri ile metilasyon durumları arasında anlamlı bir ilişki gözlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Kadmiyum stresi, DNA Metilasyonu, qAMP, Gen Ekspresyonu

Purpose: Factors such as chemical fertilizers used in recent years, incorrect irrigation techniques, changing climatic conditions increase the accumulation of cadmium (Cd) heavy metal in the soil. In study, it was aimed to determine the expression levels of stress-related genes in the plant and the methylation levels for the first time by Real-Time PCR-based quantitative DNA methylation analysis (qAMP) after Cd stress applied at different concentrations to bread wheat (Triticum aestivum L.), which is an important agricultural product.Method: The development of wheat plants exposed to Cd stress at doses of 0,100, 250, 500 µM was achieved and DNA and RNA isolations were performed from these plants. cDNA synthesis was made from the obtained RNA samples and gene expression analyzes were performed with the cDNAs produced by designing primers specific to the selected gene regions. DNA methylation rates were determined by applying the restriction enzyme-based qAMP technique and the obtained results were compared with gene expression analysis.Findings: Gene expression levels and DNA methylation percentages of UGT-3, LTP-4 and PIP-1 genes were determined under CdCl2 stress applied at doses of 0.100, 250, 500 µM. The percentage of methylation in the UGT-3, LTP-4 and PIP-1 genes was determined at the highest concentration of 250 µM in both the stem and root. The expression level of the UGT-3 gene gave the highest rate at 250 µM concentration in the stem, while the overexpression of the LTP-4 gene was observed at 250 µM concentration in the root.Results: Changes in methylation rates of UGT-3, LTP-4 and PIP-1 genes were investigated for the first time with qAMP, a new technique used in plants. A significant correlation was observed between the expression levels of genes and their methylation status.Keywords: Cadmium stress, DNA Methylation, qAMP, Gene Expression