Liken asitlerinin insan akciğer kanser hücre hattı üzerine tiyoredoksin redüktaz hedefli antikanser etkisinin gen ve protein seviyesinde araştırılması

Abstract

Amaç: Bu tez çalışmasında evernik, vulpinik, difraktaik ve lekanorik liken asitlerinin insan akciğer (A549) kanser hücre hattı üzerinde antikanser ajan olarak kullanılıp kullanılamayacağının ve olası antikanser etkinin tiyoredoksin redüktaz 1 (TRXR1) hedefli gerçekleşip gerçekleşmediğinin gen ve protein seviyesinde araştırılması amaçlanmıştır.Yöntem: A549 hücre hattı, bahsedilen liken asitlerinin farklı konsantrasyonları ile muamele edilerek sitotoksik etkisi XTT testiyle incelendi. Liken asitlerinin etkin olduğu IC50 konsantrasyonu ve zamanı belirlendikten sonra, apoptoz ve migrasyon üzerine etkileri Annexin V-FITC yöntemi ve yara iyileştirme testiyle araştırıldı. Bu liken asitlerinin apoptotik yolak genleri olan BAX, BCL2, P53 ve tiyoredoksin sistem genleri olan TRXR1 ve tiyoredoksinin (TXN) kantitatif ekspresyonu üzerine etkileri Real-Time PCR ile araştırıldı. Ayrıca, bahsedilen liken asitlerinin TRXR1'in kantitatif protein ekspresyonuna ve enzim aktivitesi üzerine etkileri western blot ve DTNB yöntemleriyle incelendi.Bulgular: A549 hücre hattı üzerinde evernik, vulpinik ve difraktaik asitlerin doz ve zaman bağımlı olarak sitotoksik etkisi olduğu gözlendi. Lekanorik asit ise 250 µg/mL'e kadar sitotoksik aktivite göstermedi. Evernik asidin düşük-orta derecede apoptotik etkiye sahip olduğu, vulpinik ve difraktaik asidin apoptotik etkisinin evernik aside kıyasla yüksek olduğu belirlendi. Vulpinik ve difraktaik asidin BAX/BCL2 oranını ve P53 gen ekspresyonunu artırdığı, evernik asidin ise sadece BAX/BCL2 oranını artırdığı saptandı. Bu üç liken asidinin migrasyonu baskıladığı, TRXR1 gen ve protein seviyelerinde değişiklik oluşturmadığı, TXN gen ekspresyon seviyesini artırdığı ve TRXR1 enzim aktivitesini önemli ölçüde inhibe ettiği gözlendi.Sonuç: Bu bulgular evernik, vulpinik ve difraktaik liken asitlerinin A549 kanser hücre hattı üzerinde TRXR1 hedefli olarak antikanser özellik gösterdiği ve bu liken asitlerinin potansiyel kemoterapötik ajan olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, Kemoterapötik ajan, Liken asidi, Tiyoredoksin redüktaz 1, Enzim aktivitesi

Purpose: In this thesis, it is aimed to investigate whether evernic, vulpinic, diffractaic and lecanoric lichen acids can be used as anticancer agents on human lung (A549) cancer cell line and whether this possible anticancer effect occurs thioredoxin reductase 1 (TRXR1)-targeted at gene and protein levels.Method: A549 cell line was treated with different concentrations of the aforementioned lichen acids and their cytotoxic effect was examined by XTT assay. After determining the IC50 concentration and time at which lichen acids are effective, their effects on apoptosis and migration were investigated by Annexin V-FITC method and with wound healing assay, respectively. The effects of these lichen acids on quantitative expression of apoptotic pathway genes BAX, BCL2, P53 and thioredoxin system genes TRXR1 and thioredoxin (TXN) were investigated by Real-Time PCR. Furthermore, the effects of aforementioned lichen acids on the quantitative protein expression and enzyme activity of TRXR1 were examined by western blot method and DTNB method, respectively.Findings: It was observed that evernic, vulpinic, and diffractaic acids have dose- and time- dependent cytotoxic effects on A549 cell line. Lecanoric acid did not show cytotoxic activity by 250 µg/mL. It was determined that evernic acid had a low-moderate apoptotic effect and the apoptotic effect of vulpinic and diffractaic acids were higher than evernic acid. It was found that vulpinic and diffractaic acids increased the BAX/BCL2 ratio and P53 gene expression, while evernic acid only increased the BAX/BCL2 ratio. It was observed that these three lichen acids suppressed migration, did not cause changes in TRXR1 gene and protein expressions, increased TXN gene expression level, and significantly inhibited TRXR1 activity.Results: These findings suggest that evernic, vulpinic, and diffractaic lichen acids show anticancer properties on the A549 cancer cell line by targeting TRXR1 and these lichen acids can be used as potential chemotherapeutic agents. Keywords: Lung cancer, Chemotherapeutic agent, Lichen acid, Thioredoxin reductase 1, Enzyme activity