Development of a pseudovirus-based assay for analysis of neutralizing activity against SARS-CoV-2

Abstract

Şiddetli Akut Solunum Yolu Sendromu Koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu COVID-19 pandemisi dünya çapında yayılmaya devam ederken, etkin aşı protokolleri aktif olarak uygulanmaya başlanmıştır. Aşıların özellikle gelişmekte olan ülkelere geç dağılması ve etkin bir antiviral tedavinin olmaması, konvelesan plazma (CP) veya monoklonal antikor gibi kullanımı gibi yaklaşımlara olan ilgiyi artırmıştır. İlk klinik değerlendirmeler, eğer tedaviden bir fayda bekleniyorsa, CP veya antikor bazlı yaklaşımlarda yanıtı belirleyen kritik faktörlerin net bir şekilde tanımlanması gerektiğini ortaya koydu. Vahşitip virüs kullanılarak SARS-CoV-2'ye karşı nötralizan aktivitenin ölçülmesi güvenilir bir fonksiyonel analiz sunmaktadır ancak virüs kültürü için uygun olan Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) tesislerinin yaygın olmaması, bu yöntemin uygulanabilirliğini kısıtlamaktadır. Bunun yerine, SARS-CoV-2 virüsünden parçalar içeren Psödovirüslerin kullanımı, konvelasan plazma veya diğer nötralize edici ajanların aktivitesini belirlemek için yaygın olarak kullanılabilir.Bu tezde, nötralizan aktivitenin ölçümünde kullanılmak üzere SARS-CoV-2 Spike (S), Membran (M), Zarf (E) ve Nükleokapsid (N) proteinleri ile psödotiplenmiş lentiviral partiküllerin üretimine yönelik yaklaşımımızı sunuyoruz. Buna ek olarak, kısa sürede çoklu numunelerin daha hızlı ve pratik analizini mümkün kulabilmek amacıyla Yeşil Floresan Protein (GFP) veya Salgılanmış Alkalin Fosfataz (SEAP) gibi farklı transgenleri, raportör genler olarak değerlendiriyoruz. Bulgularımız, optimize edilmiş SEAP tabanlı yöntemlerin kullanılmasının, gelişmiş ekipman ihtiyacını ortadan kaldırarak nötralizasyon testlerinin hızını ve dolayısıyla da yaygınlığını artırabileceğini göstermektedir.

As the COVID-19 pandemic caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to spread around the globe, effective vaccination protocols are actively being implemented. The delayed deployment of effective vaccines especially in the developing world and the lack of an effective antiviral treatment inadvertently increased the interest in approaches such as the use of convalescent plasma (CP) or monoclonal antibody products. Initial clinical evaluation revealed that critical factors determining the outcome of CP or antibody-based therapies need to be defined clearly if clinical efficacy is to be expected. Measurement of neutralizing activity against SARS-CoV-2 using wildtype virus presents a reliable functional assay but the availability of suitable BSL3 facilities for virus culture restricts its applicability. Instead, the use of pseudovirus particles containing elements from the SARS-CoV-2 virus is widely applied to determine the activity of CP or other neutralizing agents. In this thesis, we present our approach to production of lentiviral particles pseudotyped with the SARS-CoV-2 Spike (S), Membrane (M), Envelope (E) and Nucleocapsid (N) proteins for use in neutralization. Furthermore, we evaluate different transgenes such as the Green Fluorescent Protein (GFP) or Secreted Alkalline Phosphatase (SEAP) as reporter genes in an attempt to develop faster and more practical analysis of multiple samples in a short time. Our findings show that the use of optimized SEAP-based methods can increase the availability of neutralizing assays by overcoming the need for advanced equipment and increase the processing speed of multiple samples in a given lab.