Isolation and characterization of nanobodies that bind the BTB domain of PATZ1 transcription factor

Abstract

PATZ1, ZBTB protein ailesine ait bir transkripsiyon faktörüdür. Kolorektal ve testiküler tümörler gibi bazı tümör tiplerinde aşırı üretildiği bulunmuş ve bu özelliğiyle proto-onkogen özelliği önerilmiştir. Fakat bu durumun ayrıntıları hala bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı, PATZ1-BTB domaininin yapı ve fonksiyon karakterizasyonu için tesirli ve seçilmiş nanokorlar üretmektir. Bu amaçla, bir faj gösterimi kütüphanesi PATZ1-BTB bağlanıcıları için tarandı. Aday bağlanıcılar ELISA ile analiz edildi, E. coli bakterisinde üretildi ve afinite ve boyut dışlama kromatografisi ile temizlendi. Yüzey plazmon rezonans ile bağlanma afiniteleri ölçüldü. Daha öte özgüllük ve afinite analizi için flüoresan iki-hibrit analizi ve boyut dışlama kromatografisi kullanıldı. Seçilen nanokorların PATZ1'ın hedef genlerine (CTH, ETV1) etkisi gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü. Nanomolar afiniteye sahip üç nanokor çözünür proteinler şeklinde yüksek konsantrasyonlarda üretildi. Birlikte elüsyon analizi ile nanokorlar ile PATZ1-BTB domaini arasında özel kompleks oluşumu gözlemlendi. Flüoresan iki-hibrit analizi ile nanokorlar ile hedef proteinlerinin kolokalizasyonu canlı hücrelerin çekirdeklerinde gözlemlendi. Hücre içinde stabil bir şekilde üretilen PATZ1-BTB domainini hedefleyen nanokorlar ETV1 gene okunmasını kayda değer derecede arttırırken CTH gene okunmasını azalttı. Sonuçlarımız nanokorlar ile PATZ1-BTB domaini arasındaki özel bağlanmanın gen regülasyonuna etkisi olabileceğini önermektedir. Bu konuda yapılacak araştırmalar sonucunda nanokorların PATZ1 modülatörü olarak kullanılıp kullanılamayacağı netlik kazanacaktır.

PATZ1 is a transcription factor that belongs to the ZBTB protein family. It is found to be overexpressed in some human malignancies such as colorectal and testicular tumors, suggesting a proto-oncogenic role. However, this association remains poorly understood. The aim of this study was to generate potent and selective nanobodies against the PATZ1-BTB domain to assist the characterization of its structure and function. For this, a phage display nanobody library was screened for PATZ1-BTB domain binders. Candidate binders were analyzed by ELISA, expressed in E. coli and purified using affinity and size exclusion chromatography. Binding affinities were determined using surface plasmon resonance. Size-exclusion chromatography and a fluorescent two-hybrid assay were used for further assessment of specificity and affinity. The effect of the selected nanobodies on the expression levels of the known PATZ1 target genes (CTH, ETV1) was assessed using real-time PCR. Three nanobody clones with nanomolar affinities were produced as soluble proteins at high concentration. Co-elution analysis showed specific complex formation between these nanobodies and the PATZ1-BTB domain. In the fluorescent two- hybrid assay, these nanobodies showed colocalization with their target protein in the nuclei of live cells. Intracellular stable expression of PATZ1-BTB domain-targeting nanobodies resulted in significant increase of ETV1 gene expression and decrease of the CTH target gene. Our results suggest that the specific binding of nanobodies to the BTB domain of PATZ1 might regulate its gene transcriptional activity. Further investigation will clarify if these nanobodies might be used as PATZ1 modulators.