Baklagillerden protein ve fenolik bileşenlerin inovatif yöntemlerle eldesi, nanolif üretimi, enkapsülasyon ve biyofonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

Tez çalışması iki bölümden oluşmakta olup birinci bölümde baklagillerden protein ekstraksiyonun optimizasyonu çalışılmıştır. Bu amaçla öncelikle ultrases destekli derin ötektik çözücü (UD-DÖÇ) ekstraksiyonunda kullanılacak olan DÖÇ'e karar vermek amacıyla kolin klorür (ChCl) bazlı farklı hidrojen vericileri ile DÖÇ'ler oluşturulmuştur. Bağımsız değişkenler için belirlenen en düşük noktalarda farklı DÖÇ'ler ile ekstraksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Çözücü belirleme aşamasında en yüksek protein ekstraskiyon değerleri yeşil mercimek ve nohut için sırasıyla 19,1 ve 22,3 mg BSA/g olarak ChCl:üre ile oluşturulan DÖÇ'ten elde edilmiştir. UD optimizasyon aşamasında bağımsız değişkenler üre molar oranı, su molar oranı, ultrases gücü ve süre, cevap faktörü olarak ise protein içeriği seçilmiştir. Optimum ekstraksiyon koşulları belirlendikten sonra ekstraksiyon etkinliği ortaya koyma amacıyla geleneksel yöntemle su ve DÖÇ kullanılarak ekstraksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Optimizasyonda belirlenen noktalarda elde edilen UD-DÖÇ yeşil mercimek ve nohut örnekleri için protein içeriği sırasıyla 38,50±2,01 ve 25,84±0,37 mg BSA/g olarak belirlenmiştir. K-DÖÇ ve su ekstraktları protein içerikleri yeşil mercimek için sırasıyla 20,61±0,75 ve 16,05±1,37 mg BSA/g, nohut için ise 18,14±0,52 ve 1,65±0,96 mg BSA/g bulunmuştur.Yeşil mercimek ve nohuttan elde edilen UD-DÖÇ protein ekstraktları için DPPH radikal süpürücü aktiviteleri sırasıyla %28,79±0,86 ve %15,31±0,39 olarak, Fe-şelatlama aktiviteleri 22,96±0,91 ve 19,06±2,17 μmol EDTA/g olarak belirlenmiştir. Farklı pH'larda en yüksek çözünürlük değerleri UD-DÖÇ örneklerinden elde edilmiştir.UD-DÖÇ yöntemi ile elde edilen protein ekstraktlarının elektrospining yöntemiyle nanolif üretiminde kullanılma potansiyeli araştırılmıştır. Tek başına nanolif oluşturma özelliği olmayan yeşil mercimek protein izolatı (MPI) ve nohut protein izolatı (NPI) farklı konsantrasyonlarda polivinil alkol (PVA) ve zein ile karıştırılarak lif üretilmiştir. Hazırlanan PVA ve protein solüsyonları farklı oranlarda karıştırılmış ancak 40:60 w:w (PVA:PI) ve altındaki oranlarda her iki PI içinde nanolif üretimi gerçekleştirilememiştir. Zein ile yapılan çalışmada ise 70:30 w:w (zein:PI) ve altında nanolif oluşmamıştır. PVA ile elde edilen MPI ve NPI nanoliflerinin protein içeriği arttıkça nanolif kalınlığının azaldığı görülmüştür. 70:30, 60:40 ve 50:50 w:w PVA:MPI nanolifleri için çaplar sırasıyla 0,140±0,00, 0,133±0,00 ve 0,114±0,00μm iken PVA:NPI nanolifleri için 0,159±0,01, 0,128±0,01 e 0,110±0,1 μm olarak bulunmuştur. Elde edilen taramalı elekron mikroskopisi (SEM) görüntüleri ve nanolif çaplarına göre ayrıca reolojik ve elektrik iletkenlik özellikleri dikkate alınarak 50:50 w:w (PVA:PI) ile nanolif üretilebileceğine karar verilmiştir. Aynı işlemler zein kullanılarak da gerçekleştirilmiş ve 90:10 ve 80:20 w:w zein:MPI nanolifleri için çap ölçüleri 0,144±0,00 ve 0,214±0,01 μm ve zein:NPI için ise sırasıyla 0,125 ±0,00 ve 0,386±0,01 μm olarak bulunmuştur. SEM görüntüleri ve nanolif çapları ile reolojik ve elektrik iletkenlik özellikleri değerlendirilerek 80:20 w:w (zein:PI) oranda nanolif üretilebileceğine karar verilmiştir.50:50 w:w PVA:PI ve 80:20 w:w zein:PI ile üretilen nanoliflerin enkapsülasyon özellikleri ve antioksidanlar için taşıyıcı olarak kullanılabilme potansiyeli ferulik asit ile araştırılmıştır. Bu amaçla hazırlanan elektrospining solüsyonlarına %2 (w/w) ferulik asit ilave edilmiş ve ferulik asitin nanolifler içinde ki dağılımı floresans mikroskobu ile doğrulanmıştır. Elde edilen ferulik asit yüklü nanoliflerin antibakteriyel özellikleri değerlendirilmiştir. Bakteri koloni sayısında ferulik asit yüklü PVA kontrol örneğinde kontrole göre %71,3'lük bir azalma söz konusuyken, ferulik asit yüklü PVA:MPI'da %82,1 ve PVA:NPI'da ise %78,9 azalma belirlenmiştir. Zein ile elde edilen nanolifler de ise ferulik asit yüklü kontrol nanolifinde kontrole göre %67,5'lik bir azalma varken zein:MPI ve zein:NPI örnekleri için koloni sayıları sırasıyla %96,2 ve %95,1 azalmıştır. Ayrıca üretilen nanoliflerin hidrofilik ve hidrofobik ortamlarda ve in vitro koşullardaki salınım profili incelenmiş ve salınım için bir kinetik çalışma yapılmıştır. Genel olarak nanoliflerde hidrofilik ortamda ferulik asit salınımı daha uzun sürede ve daha yavaş, hidrofobik ortamda ise kısa sürede daha yüksek miktarlarda salınım gerçekleştiği görülmüştür. Bu sonuçlar yeşil mercimek ve nohuttan UD-DÖÇ ile elde edilen PI'ların inovatif yöntemlerle kısa sürede ve en az çözücü kullanımı ile ekstrakte edilebileceği ve elde edilen materyalin yüksek antioksidan özelliklere sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca baklagil PI'larının elektrospining yöntemiyle nanolif üretiminde kullanılabileceği böylelikle besin değeri yüksek, antioksidan ve antibakteriyel özelliklere sahip nanolifler elde edilebilme potansiyelinin olduğu belirlenmiştir.Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise mikrodalga destekli sulu iki faz (MD-SİF) sistem ile baklagillerden fenolik bileşen ekstraksiyonu çalışılmıştır. Bu kısımda baklagil olarak yeşil mercimek, nohut ve kuru fasulye örnekleri ile çalışılmıştır. Fenolik bileşenlerin geri kazanımı cevap yüzey yöntemi (RSM) kullanılarak optimize edilmiştir. Ekstraktların DPPH radikal süpürücü ve ABTS antioksidan aktiviteleri ile Fe-şelatlama aktiviteleri belirlenmiştir. MD-SİF ekstraktlarından en yüksek ekstraksiyon verimi yeşil mercimek, nohut ve kuru fasulye için sırasıyla 6,68, 2,10 ve 1,69 mg GAE/g ve en yüksek antioksidan değerler elde edilmiştir. Yeşil mercimek, nohut ve kuru fasulye MD-SİF ekstraktları için DPPH radikal süpürücü aktiviteleri sırasıyla 70,98±1,96, 7,60±0,00 ve 9,68±1,19 μmol TE/g, ABTS antioksidan süpürücü aktiviteler 27,96±0,49, 13,09±0,13 ve 9,09±0,1 μg TE/g ayrıca Fe-şelatlama aktiviteleri %56,97±1,22, %71,63±0,62 ve 78,6±1,02 olarak belirlenmiştir. Fenolik ekstraktlar maltodekstrin kullanılarak dondurarak kurutma yöntemiyle enkapsüle edilmiştir. Örneklerin yapısal özellikleri SEM ve Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi yardımıyla karakterize edilmiş ve salınım profilleri suda mide ve bağırsak ortamında belirlenmiştir. Ayrıca hızlandırılmış depolama koşulları altında ekstraktların ayçiçek yağı oksidatif stabilitesine etkileri test edilmiş, MD-SİF ile elde edilen ekstraktların yağın oksidatif stabilitesine önemli bir etkisinin olduğu ancak yapay bir antioksidan olan BHA kadar etkin olmadığı belirlenmiştir. Bu sonuçlar MD-SİF'in baklagillerden fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için verimli bir çevre dostu yöntem olarak kabul edilebileceğini göstermektedir.Yapılan bu tez çalışması ile baklagillerden alternatif ve yeşil çözücüler ile inovatif yöntemler kullanılarak hem protein hem de fenolik bileşen ekstraksiyonu gerçekleştirilmiş ve verimde önemli (p<0,05) artışlar sağlanmıştır. Baklagillerin katma değerini artıracak, gıda endüstrisinde ambalaj malzemesi veya enkapsülasyon aracı olarak kullanılabilme potansiyeline sahip protein bazlı nanolifler ile antioksidan özelliklere sahip katkı maddesi olarak değerlendirilebilecek enkapsüle fenolik bileşenler elde edilmiştir. Çalışma verilerinin özellikle baklagil işlemede elek altı olarak ortaya çıkan ve katma değeri düşük olan yan ürünlerin de değerlendirilmesine katkı sağlaması mümkün olacaktır.

The thesis consists of two parts, the optimization of protein extraction from legumes by ultrasound-assisted deep eutectic solvent (US-DES) was studied in the first part. First of all, Deep eutectic solvent (DES) was created with different hydrogen donors using choline chloride (ChCl) as hydrogen acceptor to decide on the DES to be used. The highest protein extraction values were obtained from DES formed with ChCl: urea as 19.1 and 22.3 mg BSA/g for green lentils and chickpeas, respectively. In the ultrasound-assisted optimization phase, the independent variables of optimization were urea molar ratio, water molar ratio, ultrasound power, and time. The protein content of extracts was considered as the response factor. After the optimum extraction conditions were determined, a comparison study was conducted to test the efficiency of the extraction. For this purpose, extractions were carried out using the traditional method using DES (C-DES) and water (C-water). The protein content of protein isolate was determined for US-DES as 38.50±2.01 and 25.84±0.37 mg BSA/g for green lentil and chickpea samples, respectively in optimization. Protein contents of extracts of C-DES and C-water obtained from green lentils were found as 20.61±0.75 and 16.05±1.37, respectively. The C-DES and C-water values for the extracts obtained from chickpea were found as 18.14±0.52 and 11.65±0.96 mg BSA/g, consecutively. The DPPH radical scavenging activity results of US-DES protein extracts derived from green lentils and chickpea were determined as 28.79±0.86% and 15.31±0.39%, respectively. The Fe-chelating activities of US-DES protein extracts obtained from green lentils and chickpea were determined as 22.96±0.91 and 19.06±2.17 μmol EDTA/g, consecutively. The highest solubility values at different pHs were obtained from US-DES samples in protein solubility. Not only the extraction efficiency but also the antioxidant properties increased through US-DES. The potential of using protein isolates (PI) produced by the US-DES method in nanofiber production by electrospinning method was investigated. Green lentil protein isolate (LPI) and chickpea protein isolate (CPI) that do not have fiber-forming properties were mixed with different concentrations of polyvinyl alcohol (PVA) and zein for producing nanofiber. It was aimed to make fiber with the greatest protein ratio possible in this section. The prepared PVA:PI were mixed at different ratios (70:30, 60:40, 50:50, 40:60), and nanofiber production could not be performed in 40:60 (PVA:PI) and below. The prepared zein:PI were mixed different ratios (90:10, 80:20, 70:30). However, nanofiber production could not be performed in both PI at ratios of 70:30 (zein:PI) and below. It was observed that the fiber thickness decreased as the protein content of LPI and CPI increased in fibers obtained with PVA. The diameters of fiber produced with PVA:LPI (70:30, 60:40 and 50:50) were found as 0.140±0.00, 0.133±0.00 and 0.114±0.00 μm, while the diameters of PVA:CPI were 0.159±0.01, 0.128±0.01 e 0.11±0.1 μm, respectively. It was decided that nanofibers could be produced at a ratio of 50:50 (PVA:PI) by examining the scanning electron microscopy (SEM) images and fiber diameters, also according to rheological and electrical conductivity properties. The same process was carried out using zein. The diameters of fiber produced with zein:LPI (90:10, 80:20) were found as 0.144±0.00 ve 0.214±0.01 μm, while the diameters of zein:CPI were 0.125±0.00 ve 0.386±0.01 μm, respectively. It was decided that nanofibers could be produced at a ratio of 80:20 (zein:PI) by looking at SEM images and fiber diameters, also according to rheological and electrical conductivity properties.The encapsulation properties of produced fibers (50:50 PVA:PI and 80:20 zein:PI) and their use as a carrier for antioxidants were investigated with ferulic acid. For this purpose, 2% ferulic was added to the electrospinning solutions. The distribution of ferulic acid within the fibers was confirmed by fluorescence microscopy. In addition, the antibacterial properties of the produced ferulic acid-loaded fibers were evaluated. Considering the % reductions in the number of bacterial colonies, there was a 71.3% decrease in the ferulic acid-loaded PVA control sample compared to the control, while this value increased to 82.1% and 78.9% in ferulic acid-loaded PVA:LPI and in PVA:CPI, respectively. In the fibers obtained with zein, there was a 67.5% decrease in the ferulic acid-loaded zein control fiber compared to the control, while the colony numbers of samples decreased at 96.2% and 95.1% for zein:MPI and zein:NPI, respectively.In addition, the release profile of the produced fibers in hydrophilic and hydrophobic food environments and in vitro conditions was examined and a kinetic study was carried out for the release properties. In general, the application of fibers in hydrophilic foods resulted in a longer and slower release. It was observed that higher amounts of ferulic acid were released in a short time in the hydrophobic food environment. According to the results of the thesis study, US-DES provided high antioxidant properties, besides the short extraction time and solvent savings. It was determined that the use of US-DES is a suitable method to obtain protein isolates from legumes. In addition, legume protein isolates can be used in the production of nanofibers by electrospinning. Thus, nanofibers with high nutritional value, antioxidant and antibacterial properties can be produced.In the second part of the current thesis, a microwave-assisted two-phase aqueous system (MA-ATPS) was used to study the extraction of phenolic components from legumes. Green lentils, chickpeas, and dried beans were examined as legumes in this section. By using response surface methodology (RSM), the recovery of phenolic chemicals by MA-ATPS was optimized. Traditional mono-phase extraction ATPS (C-ATPS) and conventional (C-water) were used in a comparison research. The ability of extracts to scavenge DPPH, serve as an antioxidant via ABTS, and chelate iron was measured. The highest extraction yield (6.68, 2.10, and 1.69 mg GAE/ g sample for green lentil, chickpea, and dry bean, respectively) and antioxidant properties (70.98, 7.60, and 9.68 μmol TE/g for DPPH scavenging activity for green lentil, chickpea, and dry bean, respectively) were observed from the extracts obtained by MA-ATPS. Additionally, the phenolic extracts were freeze dried to form microcapsules, and SEM and Fourier Transform Infrared (FTIR) spectrometry were used to characterize the structure of the microcapsules. Release profiles were determined in the gastric and intestinal environment in water. Additionally, under accelerated storage circumstances, the effects of extracts on the oxidative stability of sunflower oil were evaluated. The results of this study demonstrated that the MA-ATPS might be regarded as an effective, environmentally acceptable method for extracting phenolic compounds from pulses, as demonstrated by the extracts' antioxidant activity. Moreover, the encapsulated pulse phenolic extracts may serve as an alternative ingredient for the food industry to be used in various functional formulations potentially leading to an increase in the value of green lentil, chickpea, and dry bean and possibly their by-products.With this thesis study, both protein and phenolic component extraction was carried out from legumes by using alternative and green solvents and innovative methods, and significant (p<0.05) increases in yield were achieved. Protein-based nanofibers, which will increase the added value of legumes and have the potential to be used as packaging material or encapsulation tool in the food industry, and encapsulated phenolic components that can be considered as additives with antioxidant properties have been obtained. It will be possible for the study data to contribute to the evaluation of the by-products that accumulate as under sieve material in legume processing and have low added value.