Pseudomonas aeruginosa quorum sensing inhibitörü liken sekonder metabolitlerinin ve inhibisyon mekanizmalarının belirlenmesi

Abstract

Fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa'nın patojenitesinin, çevresindeki organizmalar tarafından algılanabilecek moleküller ile iletişimine dayalı `salt çoğunluk algılama` (Quorum Sensing, QS) ile düzenlendiği bilinmektedir. Bakterileri öldürmeden QS sistemlerini inhibe ederek onları etkisiz ve savunmasız halde bırakmak `quorum quenching` (QQ) olarak isimlendirilmekte ve anti-virulans yaklaşımlar arasında önemli bir yol olarak kabul edilmektedir. Yeni QS inhibitörü metabolitlerin araştırılmasında çoğunlukla doğal kaynaklar kullanılmaktadır. Likenler, geniş ve kendilerine özgü sekonder metabolitleri ile bu bağlamda yüksek potansiyele sahiplerdir.Bu çalışmanın amacı ülkemiz liken türlerine ait özütlerin P. aeruginosa üzerindeki QQ etkilerini belirlemek, etkili türlerin sekonder metabolit içeriklerini analiz etmek, baskın olarak bulunan sekonder metabolitlerin seçilerek QS bağlantılı virulans faktörleri üzerindeki etkilerini incelemek ve P. aeruginosa transkriptomunda meydana gelen değişiklikleri araştırmaktır. Çalışmada farklı bölgelerden 17 liken türüne ait 34 örnek toplanmış, referans ve GFP temelli biyomonitör suşlar kullanılarak QS ve biyofilm inhibitörü içerebilecek etkili örnekler belirlenmiştir. Kromatografik yöntemler ile etkili özütlerin içerikleri analiz edilmiştir. Seçilen atranorin ve psoromik asit saf metabolitlerin P. aeruginosa QS, biyofilm ve virulans faktörlerine karşı inhibisyon miktarları monitör suşlar, biyokimyasal analizler ve kRT-PZR yöntemleri kullanılarak kantitatif olarak belirlenmiştir. İki metabolitin de uygulanan konsantrasyonlarda yüksek virulans inhibisyonu gerçekleştirdiği anlaşılmıştır. Ayrıca, insan fibroblast hücre hattında canlılığa olan etkileri araştırılmış ve atranorinin canlılığı %50 kadar azalttığı tespit edilmiştir. Psoromik asit uygulaması yapılan P. aeruginosa transkriptomunda gerçekleşen tüm değişimler yeni-nesil RNA sekanslama aracılığı ile incelenmiştir. Sonuçlara göre QS bağlantılı genler dahil toplam 533 genin aşağı-regüle, 664 genin ise yukarı regüle olduğu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, likenlerin QS inhibisyonu için önemli bir kaynak olabileceğini ve psoromik asit metabolitinin P. aeruginosa'ya karşı bu amaçla kullanılabileceğini öne sürmektedir.

Opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa regulates its pathogenicity through communication via small and diffusible molecules, that is called `quorum sensing` (QS). Inhibition of QS systems without killing the bacteria and thus leaving them ineffective and vulnerable is called `quorum quenching` (QQ), which is considered an important method for anti-virulence approach. Natural resources are used in search for new QS inhibitor metabolites. Lichens have high potential in this context with their unique and broad range of secondary metabolites.The aim of this study is to determine the QQ effects of extracts from lichen species in our country on P. aeruginosa, to analyze secondary metabolite contents of the effective species, to examine the effects of dominant secondary metabolites on QS-related virulence factors and to investigate the changes in P. aeruginosa transcriptome. To this end, 34 samples belonging to 17 lichen species from different regions were collected and the effective samples that may contain QS and biofilm inhibitors were determined by reference and GFP-based biomonitor strains. The metabolite ingredients of the effective extracts were analyzed via chromatographic methods. Inhibitions of selected pure metabolites of atranorine and psoromic acid against P. aeruginosa QS, biofilm and virulence factors were quantitatively determined using monitor strains, biochemical analyses and qRT-PCR methods. Both metabolites performed high virulence inhibition for the applied concentrations. In addition, the effects on viability in human fibroblast cell line were investigated and it was found that atranorine reduced viability by 50%. All changes in P. aeruginosa transcriptome treated with psoromic acid were analyzed by next-generation RNA sequencing. According to the results, a total of 533 genes, including QS related genes, were down-regulated and 664 genes were upregulated. The results obtained suggest that lichens can be an important source for QS inhibition and that the psoromic acid metabolite can be used against P. aeruginosa for this purpose.