Spinal müsküler atrofi'li drosophila melanogaster modelinde RDP3 proteini ve histon asetilasyon düzeylerinin araştırılması

Abstract

DNA-histon ilişkisinin gevşemesine ve transkripsiyonun aktivasyonuna neden olabilen histon asetilasyonu, histon proteinlerinin amino ucu kuyruk bölgelerindeki lizin amino asitlerine asetil grubu ekleyen histon asetil transferaz (HAT) enzimleri ve bu enzime tersinir olarak çalışan histon deasetilaz enzimleri (HDAC) arasındaki denge sayesinde kontrol edilmektedir. Bu dengenin bozulması nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisi ile ilişkilendirilmiş ve HDAC enzimlerini inhibe edebilen bileşikler geliştirilmiştir. Anabilim Dalı'mızda yürütülen bazı çalışmalarda da HDAC inhibitörleri sentezlenmiş, in vitro ortamda HDAC1 spesifik inhibisyon aktivitelerinin olduğu saptanmış ve bu etkinin in vivo ortamda araştırılmasına ihtiyaç duyulmuştur. Bu tez çalışması kapsamında, HDAC inhibitör aktivitesi olduğu bilinen fenilbütirik asit kullanılarak SMA'lı Drosophila melanogaster modelinde HDAC inhibitör araştırmalarında kullanılabilecek uygun evre ve koşulların belirlenmesi ve daha önce sentezlenmiş olan HDAC inhibitörlerinin etkilerinin in vivo ortamda araştırılabilmesine uygun altyapının oluşturulması amaçlanmıştır. HDAC1 enziminin Drosophila ortoloğu olan Rpd3 proteinin ifade düzeyi yabanıl tip ve SMA'lı sineklerin larva ve ergin dönemlerinde araştırılmış, ergin dönemde daha yüksek ifade edildiği görülmesine rağmen istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı gösterilmiştir. Bundan sonraki çalışmalara Rpd3 proteinin daha fazla ifade edildiği ergin dönem ile devam edilmiştir. Pupadan çıktıkları gün toplanan ergin sineklere 5 gün süreyle 5 mM ve 10 mM fenilbütirik asit uygulanmış, yapılan Western blot analizlerinde H3K18 asetilasyon düzeyinde değişiklik gözlenmezken H3K27 asetilasyon düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı artış saptanmıştır. 5 mM ve 10 mM fenilbütirik asit 10 gün süreyle uygulandığında ise H3K27 ve H3K18 asetilasyon düzeyleri değişmemiştir. Bu tez çalışması ile fenilbütirik asit'in SMA'lı Drosophila melanogaster'deki H3K27 asetilasyonunu anlamlı olarak artırdığı ilk kez gösterilmiş ve bundan sonra yapılacak olan HDAC inhibitör aktivitesi tarama çalışmalarında takip edilebilecek kriterler belirlenmiştir.

Histone acetylation causes relaxation of the DNA-histone interactions and transcriptional activation. It is controlled by the balance between histone acetyl transferase (HAT) enzymes which add acetyl groups to lysine amino acids on the N- terminal tail regions of histone proteins, and histone deacetylase enzymes (HDAC) that work reversibly to it. Disruption of this balance has been associated with the pathophysiology of neurodegenerative diseases and compounds that inhibit HDAC enzymes have been developed. In our previous studies, several HDAC inhibitors were synthesized and their HDAC1 specific inhibition activities were determined in vitro, however, in vivo effects of these compounds were needed to be investigated. This study aims to determine the appropriate stages and treatment conditions which can be used in HDAC inhibitor research in the Drosophila melanogaster model of SMA. In our study, the infrastructure to investigate in vivo effects of previously synthesized HDAC inhibitors were developed by using phenylbutyric acid as an HDAC inhibitor. The expression level of Rpd3 protein, -the Drosophila ortholog of human HDAC1- was investigated at larval and adult stages of wild type and SMA flies. Rpd3 protein level was found to be higher in adult stage than larval, however, the difference was not statistically significant, therefore, further studies were carried out with the adult stage. Flies were treated with 5 mM and 10 mM phenylbutyric acid for 5 days and then H3K27 and H3K18 acetylation levels analyzed by Western blot. Our results showed a significant increase in H3K27, but not H3K18 acetylation levels at 5 mM and 10 mM treatment. Besides, flies were treated with the same concentrations of phenylbutyric acid for 10 days and acetylation levels of H3K27 and H3K18 were analyzed. No significant change was observed neither in H3K27 nor in H3K18 acetylation levels. In conclusion, in vivo drug treatment conditions on HDAC inhibition were identified through phenylbutyric acid application and it has been shown for the first time that it increases the H3K27 acetylation level of SMA Drosophila melanogaster model.