Cloning putative voltage-gated calcium channel gene in Astacus Leptodactylus and determination of structural and functional properties of related protein

Abstract

Voltaj kapılı kalsiyum kanalları, elektrik sinyali, kasılma salgısı ve gen ifadesi gibi birçok hücresel işlemlerin gerçekleşmesinde temel unsurlardır. Memeli türlerinde kalsiyum kanallarının işlevsel ve yapısal özellikleri hakkında oldukça fazla bilgi bulunmaktadır. Kerevit, birçok deney türü için model hayvan görevi görür. Ancak kerevitlerdeki kalsiyum kanallarının moleküler ve genetik özellikleri ile ilgili herhangi bir bilgi bulunmamaktadır. Konvansiyonel klonlama yöntemleri, üç boyutlu yapısal hesaplar, docking deneyleri yapılmıştır. 7791 bp boyutunda bir mRNA klonlanmıştır. Kodlama bölgesi, 1942 amino asitli bir alfa peptidine çevrilmiştir. Klonlanmış protein sekansı, komşu türlerden gelen diğer L-tipi voltaj kapılı kalsiyum kanalı sekansları ile benzerliğe sahiptir. Üç boyutlu yapı, insan L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanalına göre hesaplanmıştır. Bilinen kalsiyum kanal blokerleri; nifedipin, verapamil ve diltiazem, hesaplanan üç boyutlu modele başarıyla bağlandı. NCBI platformundaki benzerlik analizi, üç boyutlu yapısal hesaplamalar ve docking deneyleri göz önüne alındığında, klonlanmış mRNA'nın kerevitte varsayılan voltaj kapılı kalsiyum kanalı proteini için bir alfa peptidi kodladığı sonucuna varıldı. Mevcut çalışmada, geleneksel moleküler biyoloji yöntemleri kullanılarak, varsayılan voltaj kapılı kalsiyum kanalını kodlayan mRNA tam olarak de novo klonlanmıştır. İlgili proteinin üç boyutlu yapısı hesaplanmıştır ve kanalı bloke eden birkaç farmakolojik ajan belirlenen reseptör bölgelerine yerleştirilmiştir.

Voltage-gated calcium channels are essential elements in development of many cellular processes like electrical signaling, contraction secretion and gene expression. There has been a fair amount of information about the functional and structural properties of the calcium channels in mammalian species. Crayfish serves as a model animal for many types of experiments. However, there has been no information related to the molecular and genetic properties of the calcium channels in the crayfish. Conventional cloning methods, three-dimensional structural calculations, docking experiments have been conducted. An mRNA 7791 bp in size has been cloned. The coding region has been translated into an alpha peptide with 1942 residues. The cloned protein sequence has similarity to other L-type voltage-gated calcium channel sequences from the neighboring species. Three-dimensional structure, in reference to human L-type voltage-gated calcium channel, has been calculated. Known calcium channel blockers; nifedipine, verapamil and diltiazem have been successfully docked on the calculated three-dimensional model. Considering the similarity assay in the NCBI platform, the three-dimensional structural calculations and the docking experiments it was concluded that the cloned mRNA codes an alpha peptide for a putative voltage-gated calcium channel protein in the crayfish. In the present work by using the conventional molecular biology methods complete mRNA coding a putative calcium channel was de novo cloned. Three-dimensional structure of the related protein was calculated and several pharmacological agents blocking the channel were docked to the identified receptor sites.