Hiperkolesterolemik tavşanların vasküler sisteminde Hsp90-eNOS etkileşimi

Abstract

Kardiyovasküler hastalıklar dünyadaki önde gelen ölüm nedenleri arasında yer almaktadır. Hiperkolesterolemi, hipertansiyon, tip II diyabet, ateroskleroz gibi pek çok patolojik durumun hem nedeni hem sonucu olarak endotelyal fonksiyon bozukların ortaya çıkması çok yaygın bir problemdir. Endotelyal disfonksiyona bağlı olarak da gelişebilen erektil disfonksiyon da artık kardiyovasküler hastalıklarda bir marker olarak görülmeye başlanmıştır.Çalışmamızda 6 hafta süreyle %2 kolesterolce zengin diyetle beslenen tavşanların aorta ve femoral arterlerinde ex-vivo olarak hsp90 inhibitörü ve/veya fluvastatin (30 M ex-vivo, 3 saat ve 15 saat) inkübasyonunun normal diyetle beslenen tavşanlarınkine kıyasla eNOS ve regülasyonunda rol alan proteinlerin (hsp90, eNOS, kaveolin-1 ve AMPK) ekspresyon düzeylerindeki değişim western blot yöntemiyle incelenmiştir. Ayrıca tavşan penil doku ve aortasında hsp90-eNOS kompleks varlığı ko-immunopresipitasyon deneyleriyle gösterilmiştir. Çalışmada kan kolesterol düzeyleri spektrofotometerik olarak ve aortadaki intimal alan değişiklikleri morfometrik olarak ölçülmüştür. Çalışmamızda 6 hafta %2 kolesterolce zengin diyetle beslenmenin hiperkolesterolemi ve bununla ilişkili olarak aortada intimal kalınlaşmaya neden olduğu gösterilerek hiperkolesterolemik ateroskleroz oluşturulduğu ortaya konmuştur. Hiperkolesterolemik aorta ve femoral arter dokularında kaveolin ekspresyonunun artarken eNOS, hsp90 ve AMP-aktive protein kinazın ekspresyonunun anlamlı olarak azaldığı gösterilmiştir. Fluvastatin uygulaması aortada eNOS ve hsp90 ekspresyonlarındaki azalmayı tersine çevirirken femoral arterde bunu değiştirmemiştir. Fluvastatin hiperkolesterolemik aortada AMPK ekspresyonundaki azalmayı geri çevirmemiştir. Hiperkolesterolemik tavşan aortasında görülen hsp90 ekspresyonlarındaki azalma ve kaveolin ekspresyonundaki artışın ex-vivo fluvastatin tedavisi ile geri çevrilmesi statinlerin aterosklerozdaki yararlı etkilerine hsp90'ın ve kaveolinin aracılık ettiği fikrini vermektedir. Sonuçlarımız, fluvastatin tedavisinin hipolipidemik etkilerinden bağımsız olarak hem eNOS hem de hsp90 düzeylerini artırarak hsp90 aracılı eNOS aktivasyonunda artışa ve kaveolini azaltarak kaveolin aracılı eNOS inhibisyonunda azalmaya neden olabileceğini ve buna bağlı olarak eNOS'u aktive edip aortadaki endotelyal disfonksiyonda yararlı olabileceğini göstermektedir. Öte yandan Hsp90 proteininin ATP bağlanma bölgesini inhibe ederek hsp90 aktivitesini azalttığı bilinen hsp90 inhibitörlerinin kendi başlarına eNOS, hsp90 ve kaveolin ekspresyonları üzerinde etki göstermediği bulunmuştur.Ayrıca çalışmamızda tavşan penil ve aorta dokusunda eNOS-Hsp90 kompleksinin varlığı ko-immünprespitasyon yöntemi ile gösterilmiştir. Ayrıca hiperkolesterolemiye bağlı gelişen aterosklerozda aortada hsp90-eNOS kompleks oluşumunun azaldığı görülmüştür. Çalışmamızda hiperkolesterolemik aterosklerozda hsp90 ve hsp90-eNOS düzeylerinin düştüğünün bulunması hsp90'ın aterosklerozun tedavisinde yeni bir hedef olarak önemli olabileceğine işaret edebilir.Anahtar sözcükler: hiperkolesterolemi, eNOS, hsp90, kaveolin, ampk, tavşan, aorta, femoral arter

Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the world. Endothelial dysfunction is a very common problem and it is both reason and the result of hypercholesterolemia, hypertension, type II diabetes atherosclerosis and many other pathological conditions. Erectile dysfunction may due to endothelial dysfunction and it has been started to be accepted as a marker of cardiovascular diseases.In this study, the effect of hsp90 inhibitor and/or ex-vivo as fluvastatin (30 M ex-vivo, 3 h and 15 h) incubation in aorta and femoral arteries of 6 weeks % 2 high-cholesterol diet fed rabbits compared to the normal diet fed rabbits on the expression levels of eNOS and regulatory proteins (hsp90, eNOS, caveolin-1 ve AMPK) were investigated by western blot method. Beside hsp90-eNOS complex formation in rabbit penile tissues and aorta were demonstrated by co- immunoprecipitation. Blood cholesterol levels were measured spectrophotometrically and intimal area changes in aorta were measured morphometrically.In our study, 6 weeks % 2 high-cholesterol diet fed caused hypercholesterolemia and as a result of this, intimal thickening in aorta. It has been shown that caveolin expression has been increased whereas AMP-activated protein kinase expression have been significantly decreased in hypercholesterolemic aorta and femoral artery tisues. Fluvastatin treatment reversed the reduction of expression in eNOS and hsp90 in hypercholesterolemic aorta but not in femoral artery. Fluvastatin did not effect the decrease in AMPK expressions in the hypercholesterolemic aorta.The reversal effects of fluvastatin on the reduced hsp90 and augmented caveolin expressions in hypercholesterolemic rabbit aorta suggest that hsp90 and caveolin has been mediated to the beneficial effects of atherosclerosis of statin. Our results show that, fluvastatin treatment, independent from hypolipidemic effects, may increase eNOS and hsp90 expression to cause eNOS activation through hsp90 and decrease caveolin expression which causes disinhibition of eNOS activity. These may explain why it can be beneficial in endothelial dysfunction in aorta. On the other hand it has been found that Hsp90 inhibitors which are known to reduce the activity of hsp90 by binding to ATP binding region have no effects on eNOS, hsp90 and caveolin expressions on their own.The presence of eNOS-hsp90 complex in normocholesterolemic rabbit penile and aortic tissues have been shown by co-immunoprecipitationtechnique in our study. Further we have shown that hsp90-eNOS complex formation is decreased in hypercholesterolemic aorta. Decreased hsp90 and hsp90-eNOS complex formation in atherosclerotic aorta may suggest hsp90 as a new target for treatment.Key words: : hypercholesterolemia, eNOS, hsp90, caveolin, ampk, rabbit, aorta, femoral artery