Anaerobik gut funguslarının izolasyonu, uzun süreli muhafazaları, yağ asidi ve konjuge linoleik asit üretim potansiyellerinin araştırılması

Abstract

Anaerobik gut fungusları (AGF) ve anaerobik rumen bakterileri ruminant, ruminant olmayan ve tek mideli hayvanların sindirim sistemlerinde yaşayan zorunlu anaerobik fibrolitik mikroorganizmalardır. Bu organizmalar herbivorların sindirim kanalının tüm bölgeleri ile dışkılarından izole edilebilirler. Bu çalışmada ruminant dışkılarından izole edilen Feramyces sp GMLF 30, Neocallimastix frontalis GMLF 66, Caecomyces sp GMLF 77, Feramyces sp GMLF 90, Neocallimastix sp GMLF 92, Feramyces sp GMLF 113 ve Piromyces sp GMLF 202 7 adet anaerobik gut fungusunun izolasyonu, saflaştırması ve kısmi moleküler tanımlaması başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ayrıca anaerobik gut funguslarının uzun süreli muhafazasında başarı oranının artırılmasına yönelik olarak farklı yöntemler araştırılmıştır. Buna göre roll tüp agar ve eğik agar içerisinde kültüre alınan AGF farklı sıcaklıklarda ve bunların kombinasyonunda çalışılmış ve etkin aktifleşme oranı eğik agar ile %15 gliserol kullanıldığında doğrudan -196 oC'de muhafaza işleminde elde edilmiştir. İzole edilen AGF ile bazı rumen bakterilerinin saf kültür ve kokültür olarak yetiştirildiklerinde sentezledikleri yağ asidi kompozisyonları belirlenmiştir. AGF'ler tarafından formasyonu gerçekleştirilen palmitik asit, stearik asit, oleik asit, behenik asit, linoleik asit ve konjuge linoleik asit miktarlarının diğer yağ asitlerine oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir. En yüksek konjuge linoleik asit üretimi saf kültürlerde Piromyces sp 202 izolatında ölçülürken, kokültür denemelerinde en yüksek konjuge linoleik asit üretimi ise Ruminococus albus SY3 ile Butrivibrio fibrisolvens bakterileri tarafından gerçekleştirilmiştir (bakteri x bakteri kokültür). AGF kokültür denemelerinde ise en yüksek konjuge linoleik asit formasyonu ise Butrivibrio fibrisolvens JW11 ve Caecomyces sp GMLF 77 (bakteri x AGF kokültür) izolatında elde edilmiştir. En yüksek konjuge linoleik asit formasyonu Caecomyces sp GMLG77 ile Neocallimastix sp GMLF92 (AGF x AGF kokültür) izolatlarının kokültüründe elde edilmiştir. AGF tarafından formasyonu gerçekleştirilen yağ asitlerinin bazı patojen mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal etkileri belirlenmesi tezin diğer bir araştırma konusunu oluşturmuştur. Son aşamada ise linoleat izomeraz enzimini kodlayan gen bölgesi için NCBİ da yer alannoligonükleotid dizileri kullanılarak primer tasarımı gerçekleştirilmiştir. Bu primerler kullanılarak laboratuvarımız kültür koleksiyonun da yer alan 9 farklı fungal izolat (GMLF 7, GMLF 10, GMLF 20, GMLF 22, GMLF 23, GMLF 25, GMFL 28, GEMLF 33 ve GMLF 45) için PZR ile bu enzimi kodlayan gen bölgesinin varlığı tespit edilmiştir.

Anaerobic gut fungi (AGF) and anaerobic rumen bacteria are obligate anaerobic fibrolytic microorganisms living in the digestive tracts of ruminant, non-ruminant and monogastric animals and could be isolated from all parts of the digestive tract and feces of these herbivores. In this study, putative isolation of 7 main fungi, which were putatively identified as Feramyces sp GMLF 30, Neocallimastix frontalis GMLF 66, Caecomyces sp GMLF 77, Feramyces sp GMLF 90, Neocallimastix sp GMLF 92, Feramyces sp GMLF 113 and Piromyces sp GMLF 202, were isolated from ruminant feces. and molecular identification has been carried out successfully. In addition, different methods have been investigated to increase the success rate in long-term preservation of anaerobic gout fungi. Accordingly, AGF cultured in roll tube agar and inclined agar was studied at different temperatures and their combination, and the effective activation rate was obtained directly at -196 oC when using 15% glycerol with inclined agar. When isolated AGF and some rumen bacteria were grown as pure culture and coculture, their fatty acid compositions were determined and in this context, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, behenic acid, linoleic acid and conjugated linoleic acid amounts formed by AGFs were higher than other fatty acids. determined to be high. While the highest production of conjugated linoleic acid was measured in pure cultures in Piromyces sp 202 isolate, the highest production of conjugated linoleic acid in coculture experiments was performed by the bacteria Ruminococus albus SY3 and Butrivibrio fibrisolvens (bacteria x bacteria coculture). In the AGF coculture experiments, the highest conjugated linoleic acid formation was obtained in Butrivibrio fibrisolvens JW11 and Caecomyces sp GMLF 77 isolates (bacteria x AGF coculture). The highest formation of conjugated linoleic acid was obtained in coculture of Caecomyces sp GMLG77 and Neocallimastix sp GMLF92 isolates (AGF x AGF coculture). The determination of the antimicrobial effects of fatty acids formed by AGF against some pathogenic microorganisms was another research topic of the thesis. In the last step, primer screening was performed for the gene region encoding the linoleate isomerase enzyme, using the oligonucleotide sequences in NCBI. Using these primers, the presence of the gene region encoding this enzyme by PCR for 9 different fungal isolates (GMLF 7, GMLF 10, GMLF 20, GMLF 22, GMLF 23, GMLF 25, GMFL 28, GEMLF 33 and GMLF 45) in our laboratory's culture collection detected.