Isolation, identification and molecular characterization of streptomyces from soil in halabja, Iraq

Abstract

Bu çalışmanın amacı özelde Streptomyces ve genelde actinomycetes bakterilerini Irak Halabja'sinde toplanan topraklardan izole etmektir. Bu amaçla, Halepçenin farklı 30 bölgesinde toprak numuneleri toplanarak laboratuvara getirildi ve fizikokimyasal paramatreleri ölçüldü. İlk olarak klasık izolasyon yöntemi kullanıldı. Toprak numunelerinden hazırlanan dilüsyonlar içerisine cycloheximide, nystatine ve novobiocin eklenmiş nişasta-kazein agar ve raffinoz-histidine agar petri kutularına ekim yapıldı ve toplamda substrat ve havasal miselyomlara sahip 105 koloni seçildi ve saflaştırıldı. Bütün izolatlar oatmeal agar besi ortamında havasal spor, substrat miselyum renkleri ve diffüziye pigment renkleri ve ayrıca pepton-yeast agar besi ortamında melanin üretimi dikate alınarak renk gruplandırılması yapıldı ve sonuçta 105 izolat 10 renk grubuna ayrıldı. Renk gruplarını temsilen seçilen 20 izolat 40 diagnostik teşhis testleri yapıldı ve sonrasında bilgisayara dayalı programla sonuçlar analiz edildi ve dendrogram oluşturuldu. Bu 20 test organisması 10 gruba ayrıldı ve sonuçlar renk gruplandırması ile yaklaşık benzerlik gösterdi. Filogenetik analiz için, 20 test suşunun 16S rDNA genleri genomik DNA ekstraksiyonundan sonra polimeraz zincir rekasiyonunda (PZR) evrensel primerler kullanılarak çoğaltıldı ve akabinde nükleotid zinciri belirlendi, fakat 17 test suşunun nükleotid sıralaması belirlendi. Bu 17 test suşunun 16S rDNA genlerinin nükleotidlerinin filogenetik analizi sonucu 10 suşun Streptomyces türü, ki bunlar Streptomyces badius NRRL B-2567, 5 Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber NBRC 12756 and 2 Streptomyces enissocaesilis NRRL B-16365, olarak teşhis edildi. 3 test suşuda Mesorhizobium huakuii IAM 14158 olarak teşhis edilirken 3'üde Nocardiopsis synnemataformans DSM 44143 olarak teşhis edildi. Fakat 1 suşta Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751Ts olarak teşhis edildi, fakat bu muhtemelen kontaminasyon suştur. Filogenetik analiz sonuçlarımıza göre Mesorhizobium huakuii IAM 14158 olarak teşhis edilen suş %98,45 benzerlikten dolayı ve tip türden yüksek oranda farklılık gösterdiğinden yeni tür olabilir. Yeni tür olarak yayınlamak için gelecekte DNA-DNA xii hibridisazyonu uygulanmalıdır ve bakteriyoloji biliminde mecburidir. Ayrıca tüm hücrede ve duvarında 4 test suşunun diaminopimelik amino asitd (DAP) ve şeker tipleri belirlenerek analzi edildi. 3 suşun Streptomyces türlerine has olan LL-DAP içerdiği ve glukoz, riboz and mannoz şeker tipi içerdiği belirlenirken 1 test suşuda Nocardipsis türlere özgü olan mezo-A2pm DAP ve galaktoz and riboz içerdiği belirlendi. Kemotaksonomik çalışmanın sonuçları filogenetik analiz sonuçları ile uyum gösterdi. Anahtar Kelimeler: Streptomyces, Halabja, 16S rDNA, Actinobacteria.

The aim of this study is to isolate actinomycetes, particularly Streptomyces, species from soil samples were collected from Halabja at Iraq. For this aim, total 30 soil samples were collected from the different part of Halabja and physicochemical parameters of them were measured after brought the laboratory. First of all, a conventional isolation method used to isolate Streptomyces. Ten-fold dilution of soil samples were inoculated onto strach casein agar plates supplemented cycloheximide, nystatin and novobiocin and raffinose-histidine agar plates supplemented with cycloheximide and nystatin and 105 colonies having substrate and aerial mycelium was selected and purified. All isolates presumably were colour grouped according to aerial spore mass, colony reverse and diffusible pigment colours formed on oatmeal agar and on their capacity to produce melanin pigments on peptone-yeast extract iron agar and isolates were assigned to 10 colour group. 20 representatives strains of coluor groups were tested for 40 diagnostic identification test and then the results were analyzed by computer-assisted program generating a dendrogram. These 20 test strains were assigned 10 clusters and the cluster of dendrogram showed to match those obtained by manual colour-grouping of the isolates more or less. For phylogenetic analysis, 16S rDNA genes of 20 test strains were amplified with universal primers after extraction of genomic DNA and then sequenced, but 17 of them were successfully sequenced. Phylogenetic analysis of 17 test strains carried out using base sequences of 16S rDNA genes in the core genome resulted that 10 test strains were identified as Streptomyces species those were 3 Streptomyces badius NRRL B-2567, 5 Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber NBRC 12756 and 2 Streptomyces enissocaesilis NRRL B-16365. In addition, 3 test strains were identified as Mesorhizobium huakuii IAM 14158 while 3 of them were Nocardiopsis synnemataformans DSM 44143, one of them was identified as Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751T species that may be a contaminated strains. Results of phylogenetic analysis showed that test strains identified as Mesorhizobium huakuii IAM 14158 may be a new species due to 98,45% similarity level, that is differences is to high with type species. For this reason, DNA-DNA hybridization should be carried out in future to accept new species due to essential technique for description a new species.xiv Also the diaminopimelic amino acid (DAP) content of the cell wall of 4 test strains was determined and the sugars of the whole cell hydrolysates were analyzed. 3 test strains had LL-diaminopimelic acid as the diagnostic cell wall diamino acid for Streptomyces genus, and glucose, ribose and mannose were detected in the whole cell hydrolysates while one of test strains contained mezo-A2pm DAP as diagnostic for Nocardiopsis species, and galactose and ribose in the whole cell hydrolysates. The results of chemotaxonomic studies supported the phylogenetic analysis findings. Keywords: Streptomyces, Halabja, 16S rDNA, Actinobacteria.