Süleymaniye (Irak) topraklarından streptomyces bakterılerının izolasyonu, teşhisi ve molecüler karakterisazyonu

Abstract

Bu çalışmada, Irak'ın Süleymaniye vilayetinin Pshdar ve Ranye bölgesinde toplanan 32toprak numunesinden actinomycetes cinsleri ve Streptomyces cinsine ait bakteriler izoleetmek amaçlandı. Başlangıçta toprak numunelerinin fizikokimyasal parametreleri ölçüldüve ondan sonra Streptomyces suşlarını izole etmek için içerisine cycloheximide venystatine içeren nişasta-kazein agar ve yine içerisine cycloheximide, nystatine venovobiocin antibiyotikleri eklenmiş raffinoz-histidin agar içeren petri kutularına ekimyapıldı. Toprak numunelerinde izole edilen toplam 164 Streptomyces suşu oatmeal agarbesiyerinde havasal ve substrat miselyum spor renkleri, diffüziye pigment rengi ve ayrıcapepton-yeast agar besi ortamında melanın pigment üretimi dikate alınarak gruplandırdı.Renk gruplarını temsilen seçilen 20 test suşu 40 diagnostik teste tabi tutuldu ve sonuçlarnumerik analizi yapıldı ve test suşları 10 gruba ayrıldı. Renk grupları ile numerik analizgruplarının içerdiği suşlar genelde uygunluk gösterdi. Bilgisayara dayalı renkgruplandırma analizleri hem ekolojik hemde biyolojik ürün araştırmalarında ön çalışmaolarak önemlidir.Test suşlarının filogenetik analizleri için 20'inin 16S rDNA genleri DNAekstraksiyonundan sonra evrensel primerler kullanılarak 16S rDNA genleri çoğaltıldı ve18'inin nükleotid zinciri belirlendi. Bu 18 suşun 16S rDNA genleri filogenetik analiziyapıldı ve 11'i Streptomyces türü olaral teşhis edilirken 3'ü Amycolatopsis umgeniensisUM16 ve Amycolatopsis xuchangensis CFH S0322. türü olarak teşhis edildi. 3'ü iseNocardia ignorata DSM 44496 ve Nocardia rhamnosiphila NRRL B-24637 ve 1'iLentzea flaviverrucosa AS4.0578 türü olarak teşhis edildi. 11 Streptomyces türlerinden4'ü S. Anulatus, 4'ü S. fulvissimus, 2'si S. lateritius LMG 19372 ve 1'i S. atrovirens türüolarak teşhis edildi. 16S rDNA genlerinin analiz sonucu oluşan dendogramdaki gruplarile renk gruplandırması arasında korelasyon görüldü.Yine filogenetik analiz sonucu oluşan dendogramdan seçilen 4 suşun tüm hücre şekeranalizi ve diaminopimelik asit (DAP) gibi kemotaksonomik sonuçları numerik analiz vefilogenetik analiz sonuçları uygunluk gösterdi ve önceki sonuçları destekledi. Bu verilerK02008 (13K) and K20134 (4K) suşunun Amycolatopsis xuchangensis CFH S0322xiii%99,15 oranında benzerlik gösterdiğinden yeni tür olarak kabul edimesi gerekir. FakatDNA-DNA hibdridisazyon çalışması en yakın tip suşla yapılması gerekir.Yine kemotaksonomik çalışmalar için filogenetik analiz sonucu 4 test suşu seçildi, şekeranalizi ve diaminopimelik asit (DAP) analizi yapıldı. Sonuçlar numerik ve filogenetikanaliz sonuçlari ile uyum gösterdi ve önceki çalışmalar ile desteklendi. VerilerimizK02008 (13K) ve K20134 (4K) Amycolatopsis xuchangensis CFH S0322. türüne %99.15 benzerliğinden dolayı yeni tür olabilir. Yine K18126 (6K) ve K21147 (16K)suşlarıda Lentzea flaviverrucosa AS40578 ile %99.15 benzerliğinden dolayı yeni türolması muhtemeldir. Bunun ile birlikte bütün izole edilen türlerin yeni tür olduğunuispatlamak için en yakın tip suşu ile DNA-DNA hibridizasyon çalışması yapılmasıgerekir.Anahtar Kelimeler: Streptomyces, 16S rDNA, Süleymaniye.

In this study, a total 32 soil samples collected from Pshdar and Ranya sites which aredistricts in Sulaimani governorate, Kurdistan Region of Iraq. The samples were subject toisolation of actinomycetes genera and streptomyces bacteria. Initially, physicochemicalparameters of soil samples were measured and then selective media raffinose-histidineagar supplemented with cycloheximide and nystatin, and starch-casein agar platessupplemented with same antifungal antibiotics and novobiocin, were used to isolateStreptomyces strains from soil samples. In total, 164 streptomycetes were isolated fromthe soil samples and were de-replicated manually based on: aerial spore mass, colonyreverse and diffusible pigment colours formed on oatmeal agar, and their capacity toproduce melanin pigments on peptone yeast extract iron agar.Using numerical analysis method, 40 diagnostic tests were carried out on 20representative test strains of the colour groups; the samples were assigned into 10clusters. In general, the clusters of isolates delineated in the dendrogram generated usingthe distances were found to match those obtained by manual colour-grouping of theisolates. The implications of the computer-assisted colour-grouping method forecological studies are important.For phylogenetic analysis, 16S rDNA genes of 20 test strains were amplified with 2universal primers after extraction of genomic DNA and then sequenced; however, only18 of them were successfully sequenced. These representative 18 test strains were subjectto phylogenetic analysis of DNA sequence of 16S rDNA and 11 out of 18 test strainswere identified as Streptomyces species while 3 of them identified as Amycolatopsisspecies; they were Amycolatopsis umgeniensis UM16 and Amycolatopsis xuchangensisCFH S0322. Two test strains were identified as Nocardia species and they were Nocardiaignorata DSM 44496 and Nocardia rhamnosiphila NRRL B-24637. The other two teststrains were identified as Lentzea flaviverrucosa AS4.0578 species. Out of the 11strptomyces; 4 were S. anulatus, 4 were S. fulvissimus, 2 were S. lateritius, and 1 was S.atrovirens. A reasonable linear correlation was found between the colour-group, andcorresponding dendogram that was generated after analysis of base sequence of 16SrDNA genes.Also, chemotaxonomic studies, sugar analysis and diaminopimelic acid (DAP) analysis,on 4 test strains of representatives from phylogenetic dendogram were more or less inagreement with the result of phylogenetic analysis and numerical analysis of test strains,and these are supported by previous studies. The data indicates that the K02008 (13K)and K20134 (4K) which were isolated should be recognized as new species in the genusAmycolatopsis, because they are 99,15% similar to Amycolatopsis xuchangensis CFHS0322(T). Also, K18126 (6K), and K21147 (16K) that were isolated should berecognized as new species in the genus Lentzea, since they are 99,15% similar to Lentzeaflaviverrucosa AS4.0578(T). However, all these new isolated species mentioned shouldbe further studies using DNA-DNA hybridization of the strains with nearest type strain.Keywords: Streptomyces, 16S rDNA, Sulaimani.