Purification and characterization glutathione S-transferase enzyme from japanese quail (Coturnix coturnix Japonica) heart

Abstract

Bu çalışmada; glutatyon S-transferaz enzimi (GST) bıldırcın yürek dokusundan 34,0 EÜ/mg spesifik aktivite ile %10,44 verimle 78,29 kat saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saflaştırma işlemi homojenat hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi ve glutatyon-agaroz afinite kromatografisi olmak üzere üç basamakta gerçekleştirildi. Bıldırcın yürek GST enziminin saflığını test etmek ve molekül ağırlığını belirlemek için SDS-PAGE metodu kullanıldı. Saf enzime ait altbirim molekül kütlesi 26,3 kDa olarak hesaplandı. GST enziminin aktivite ölçümü 340 nm'de spektrofometrik olarak Beutler metoduna göre yapıldı. Enzime ait karakterizasyon özellikleri sırasıyla; optimum iyonik şiddet 1,2 M Tris/HCl tamponu pH=8,0, optimum pH Tris/HCl tamponu pH=8,0, optimum sıcaklık 60 ºC ve stabil pH Tris/HCl tamponu pH=9,0 olarak belirlendi. Daha sonra bıldırcın yürek GST enzimine ait substratlar olan glutatyon ve 1-kloro 2,4-dinitrobenzen'e ait KM ve Vmax değerleri glutatyon için KM değeri 1,64 mM Vmax değeri 0,50 EÜ/mL, 1-kloro 2,4-Dinitrobenzen için KM değeri 3,88 mM Vmax değeri 0,59 EÜ/mL olarak belirlendi.Anahtar kelimeler: Bıldırcın yürek, glutatyon S-transferaz, saflaştırma, karakterizasyon.

In this study glutathione S-transferase enzyme (EC: 2.5.1.18) from the heart of Japanese quail was purified with 34.0 EU/mg specific activity, 10.44% purification yield and 78.29 purification folds and characterized. Firstly homogenate was prepared and ammonium sulfate precipitation process was performed, then the sample applied to the glutathione-agarose gel affinity column chromatography. To check the purity GST enzyme used SDS-PAGE method. Then calculated the molar mass as 26.3 kDa by SDS-PAGE method. Enzymatic activity was measured spectrofotometrically according to Beutler`s method at 340 nm. Also characterizations study done, and the results obtained are stability-pH = 9.0 in Tris/HCL buffer, optimum pH = 8.0 in Tris/HCl buffer, optimum temperature 60 °C, optimum ionic strength was 1.2 M in Tris/HCl buffer and kinetic studies performed for determined KM and Vmax for GST purified enzyme by used both glutathione and 1-chloro 2,4-dinitrobenzen as substrate, results obtained are 1.642 mM and 0.502 EU/mL respectively for GSH substrate with 3.880 mM and 0.588 EU/mL respectively for CDNB substrate. Keywords: Quail's heart, glutathione S-transferase, purification, characterizations.