İn vitro hipoksik ve hiperozmotik koşullarda matriks metalloproteinaz aktivitelerinin et ve yumurta tipi tavuklarda incelenmesi

Abstract

ÖZETBu çalışmada, asites sendromunun akut formunda şiddetli akciğer ödemine bağlıolarak şekillenen tavuk ölümlerinde, akciğer fibroblastları tarafından salgılanan matriksmetalloproteinazların (MMP-2, -9) ve matriks metalloproteinazların doku inhibitörlerinin(TIMP-1, -2) akciğer ödemi oluşumuna katkılarının olup olmadığı in vitro olarak testedilmiştir. Bu amaçla broyler ve yumurtacı tavuklardan, primer olarak akciğerdokusundan izole edilen fibroblastlar hipoksik ve hiperozmotik strese maruz bırakılarak,hücrelerdeki MMP-2, -9 ve TIMP-1,-2 enzim aktiviteleri immunositokimyasal olarakdeğerlendirilmiştir. Deneyler boyunca kullanılan akciğer bağ doku hücreleri, hiçbir aşı veilaç uygulanmamış, 1 günlük, erkek, Avian Ross ırkı broyler ve Lohman LSL ırkıyumurtacı civcivlerden primer olarak izole edilmiştir. Deneyler sırasında hipoksik ortamoluşturmak için özel kamaralar, hiperozmotik stres uygulamasında ise 160 mmol NaCliçeren M199 besleme medyumu kullanılmıştır. Deney gruplarına kontrol grupları olarakstres uygulamalarına maruz bırakılmadan karbondioksitli etüvde inkübe edilen hücrelerkullanılmıştır.Ticari olarak hazırlanmış monoklonal antikorlar ile Streptavidin Biyotin Peroksidazyöntemiyle hücreler boyanmış, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ve TIMP-2 enzimlerininaktiviteleri, hücrelerin sahip oldukları ortalama boyanma yoğunlukları hesaplanarak yarıkantitatif olarak değerlendirilmiştir.Deneylerde sonrasında hücrelerden elde edilen ortalama boyanma yoğunluklarınınhem broyler hem de yumurtacı tavuklarda kendi kontrollerinin sahip olduğu ortalamaboyanma yoğunluklarından düşük olduğu görüldü. Broyler grubuna ait hücrelerin,hipoksik, hiperozmotik ve hipoksik-hiperozmotik stres sonrası sahip oldukları ortalamaboyanma yoğunluklarının yumurtacı gruba ait hücrelerin hipoksik, hiperozmotik vehipoksik-hiperozmotik stres sonrası sahip oldukları ortalama boyanma yoğunluklarındandaha düşük olduğu tespit edildi. Sonuç olarak in vitro koşullarda stres sonrası hücrelerdensalınan enzimlerin in vivo olarak da kan damarlarının bazal membranlarında hasara yolaçarak ödem oluşumuna katkıda bulunabilecekleri düşünülmüştür.Anahtar sözcükler: Broyler, Asites, Matriks Metalloproteinaz, Hücre Kültürü,mmunositokimya, Hipoksi, Hiperozmosis.II

SUMMARYThe Investigation of the Activities of Matrix Metalloproteinases in Hypoxic andHyperosmotic Conditions in Broiler and Layer Type Chickens In Vitro.In this study, the effects of matrix metalloproteinases (MMP-2, -9) and their tissueinhibitors (TIMP-1, -2) on lung edema was investigated in an in vitro model to fullyappreciate the role of these enzymes in deaths occurring due to severe lung edema in theacute form of avian ascites syndrome.Primary lung and skin fibroblasts were isolated from 1 day old-male, non-vaccinated,Avian Ross strain broilers and Lohman LSL strain layer type chickens. The lungfibroblasts were subjected to hypoxic and hyperosmotic stress. Hypoxic conditions wereestablished by the use of special chambers, while hyperosmosis was achieved by M199medium containing 160 mmol NaCl. In the control group, fibroblasts were incubated inCO2 incubator with no stress factor application.MMP-2, -9 and TIMP-1,-2 enzyme activities in cultured fibrobasts were investigatedwith streptavidin-biotin-peroxidase method by the use of commercially availablemonoclonal antibodies. Average staining intensity was used for the semi-quantitativeevaluation of the enzymatic activity.In both the broiler and layer type chickens, the average staining intensity was lowerthan the avarage staining score of their controls. The average staining intensity of thebroiler group after hypoxic, hyperosmotic and hypoxic-hyperosmotic stress was lower thanthe values for the layer type chickens. As a conclusion, we suggest that the enzymesreleased from lung fibroblasts after stresses may damage the basement membrane of theblood vessels and may thus participate in the formation of edema in vivo.Key words: Broiler, Ascites, Matrix metalloproteinase, Cell culture,Immunocytohemistry, Hypoxia, Hyperosmosis.III