Hippokampal HT22 hücre serilerinde klotho proteininin P38 MAPK ifadesi üzerine etkisinin araştırılması

Abstract

Fare, sıçan ve insan klotho proteinini kodlayan Klotho sırasıyla kromozom 5 (5; 5 G3), 12(12p12) ve 13 ( 13q13.1) lokalizedir. Klotho geni insanlar, fareler ve sıçanlarda büyük orandakorunur. Klotho proteini, biri transmembran formunu (sırasıyla insan ve farede sırasıyla 1012ve 1014 aa, -130 kDa) ve ikincisi kısa çözülebilir formunu (550 aa, ∼70 kDa) kodlayan ikimRNA türü tarafından kodlanır. Faredeki klotho gen ekspresyonundaki bir kusur insanyaşlanmasına benzer şekilde mutant farelerde kısa bir ömür ve nöronal dejenerasyon,arterioskleroz, vasküler kalsifikasyonlar, doku kalsifikasyonları amfizem, gonadal displazi,infertilite, cilt atrofisi, ataksi, hipoglisemi ve ciddi hiperfosfatemi gibi birçok hastalığa nedenolduğu belirlenmiştir. Mitojenle aktive olan protein kinazlar (MAPK'ler) büyüme faktörleriyleve diğer sinyalleşme molekülleriyle aktifleşen ve çekirdeğe transloke olan, çeşitli hücreselfaaliyetlerin hücre içi sinyal iletimine aracılık eden serin-treonin protein kinazlardır. MemeliMAPK ailesi, hücre dışı sinyal düzenleyici kinazlar (ERK), c-Jun NH2-terminal kinazlar(JNK; ayrıca stresle aktive olan protein kinaz veya SAPK olarak da bilinir) ve p38 ailesinikapsar. p38 geni, insanlarda 6. Kromozomun p kolu üzerinde (6p21.31) lokalizedir ve 22eksondan oluşur. İnsanlarda ve farelerde p38 proteini 360 aminoasitten oluşur ve molekülağırlığı 38 kDA' dır. P38 MAPK'lar başlangıçta hiperosmolarite ve pro-enflamatuar sitokinlergibi hücresel streslere yanıt olarak aktifleşmiş proteinler olarak tanımlandı. P38 MAPK'lardört gen tarafından kodlanır. p38 MAPK'ler: MAPK14 (p38a'yı kodlayan), MAPK11 (p38β'yikodlayan), MAPK12 (p38γ'yi kodlayan) ve MAPK13 (p38δ'yi kodlayan) olarak raporedilmiştir. P38 MAP kinazlar öncelikle MAPKK izoformları, MKK3 ve MKK6 tarafındanfosforillenmek suretiyle aktive edilir. Hücre dışı uyaranlarla aktifleşen MAPK'lar çekirdeğegiderek çeşitli transkripsiyon faktörlerinin DNA'ya bağlanmasını uyarır. HT22 hippokampalhücre hattı kullanılarak Klotho proteininin p38 MAPK ifadesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Buçalışmada hücre kültürü, cDNA eldesi, Real Time PCR, protein izolasyonu ve western blotyöntemi çalışılmıştır. Elde ettiğimiz Real Time Pcr ve Western Blot sonuçları baz alındığındaklotho proteinin p38 MAPK sinyal yolağını inhibe ettiği ve nöron hücreleri üzerindekoruyucu etkisi olduğu söylenebilir ancak bunun net bir şekilde belirlenebilmesi içinfosforillenerek aktifleşen p38'in fosfo-p38 protein miktarının da çalışılması gereklidir.Anahtar kelimeler: Nörodejenerasyon, Klotho, Map Kinaz, p38 Map Kinaz, Hücre kültürü

Klotho protein is a highly conserved protein encoded by the Klotho gene localized inchromosome 5 (5; 5 G3), 12 (12p12) and 13 (13q13.1), respectively, in mouse, rat and human.The Klotho gene is alternatively transcribed into at least two mRNAs, one encoding the largetransmembrane (1012 and 1014 aa, -130 kDa, respectively in human and mouse), and theother in short soluble form (550 aa, ∼70 kDa). A defect in Klotho gene expression in themouse were caused the short life and the many diseases in mutant mice, as similar to humanaging.Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are serine-threonine protein kinases, which areactivated by growth factors and other signaling molecules and are translocated into thenucleus, mediating intracellular signal transduction of various cellular activities. Themammalian MAPK family includes extracellular signal regulatory kinases (ERK), c-JunNH2-terminal kinases (JNK; also known as stress-activated protein kinase or SAPK) and thep38 family. The p38 gene is located on the p arm of chromosome 6 in humans (6p21.31) andconsists of 22 exons. In humans and mice, the p38 protein consists of 360 amino acids and hasa molecular weight of 38 kDA. P38 MAPKs were initially identified as activated proteins inresponse to cellular stresses such as hyperosmolarity and pro-inflammatory cytokines. P38MAP kinases are activated primarily by phosphorylation by MAPKK isoforms, MKK3 andMKK6. Studies have shown that p38MAPK also has role in to responding to DNA damageand redox imbalance, which plays an important role in cellular aging.In this study, the effect of Klotho protein on p38 MAPK expression in HT22 hippocampal cellline where DNA double chain fracture was produced by endusulfan, was investigated. Whenthe Real Time PCR and Western Blot results were examined, it was observed that p38MAPKexpression, which increased approximately 100 times only in Endosulfan treated cells, waslimited in cells using Klotho protein. This is probably due to the suppression of the negativeeffects of Endosulfan by the Klotho protein. However, in order to be able to say this clearly, itis necessary to determine the level of double chain breakage in DNA and also to study thephospho-p38 protein amount of p38 which is activated by phosphorylation.Key worlds: Aging, Klotho, p38 MAPK, Cell culture