Klotho proteininin NHEJ tamir yolağındaki Ku70, Ku80 ve DNA-PK genlerinin ifadesi ve proteinlerinin işleyişi üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

Yaşlanma, zaman içerisinde canlının çevre ile olan ilişkilerinde dengelerininçevre lehine sonuçlandığı bir süreçtir. Bu sürecin ilerleyiş hızı canlının çevre ile olanetkileşimi ve kendi kalıtsal özelliklerine bağlı olarak değişir. Bu çalışmamızda,yaşlanma ile ilgili olduğu saptanan genetik faktörlerden Klotho ( Kl ) geni ele alınmıştır.Klotho geni ilk kez farelerde tanımlanan, insanda 13. kromozomun q kolunda yer alanve plazma membranında ve golgi aparatında bulunan tip 1 tek geçişli transmembranglikoproteinini kodlayan bir gendir. Klotho'nun hücre içi moleküler mekanizmalarınasıl etkilediğine yönelik bazı çalışmalar bulunsa da, özellikle yaşlanma sürecinde deetkisi bilinen DNA çift zincir kırıklarının (DSB) onarım mekanizmalarında rolüaydınlatılamamıştır. Bu çalışmada Klotho'nun DSB onarımında görevli, özellikle deHomolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) onarımında görevli bazı genlerin ifadesininasıl etkilediğini araştırmayı amaçladık.Çalışmada fare hipokampal kökenli hücre serisi olan HT22 hücrelerikullanılmıştır. DNA'da çift zincir kırığı oluşturduğu bilinen Endosülfan ile öncellikleIC50 dozu belirlenmiş, daha sonra bu doz kullanılarak farklı deney protokollerindemuamele edilen HT22 hücrelerinden RNA ve protein izolasyonu yapılmıştır. Eldeedilen total RNA'dan cDNA oluşturulmuş ve daha sonra Ku70, Ku80, DNA-PKgenlerinin ifadelerindeki değişimler RT-PCR ile belirlenmiştir. Protein seviyesindekideğişimler Western Blotlama yöntemleri ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlarçalışılan genlerin ekspresyon seviyelerinin sadece endosülfanla muamele edilenhücrelerde önemli ölçüde yükseldiğini, ama Klotho proteini de verilen hücrelerdeyükselişin olmadığını göstermiştir. Bu sonuçlar, Klotho'nün Endosülfanın zararlıetkisini minimize ettiğini ve NHEJ yolağını baskıladığını düşündürmektedir. Böyleceliteratürde ilk defa Klotho proteininin NHEJ tamir yolağındaki rolü araştırılmıştır.

Aging is a process in which the balance of the organism's relations with theenvironment over time results in favor of the environment. The rate of progress of thisprocess depends on the interaction of the organism with the environment and itsinherited characteristics. In this study the Klotho (Kl) gene, which is one of the geneticfactors associated with aging was discussed. The Klotho gene, which first described inthe mice located in the q-arm of chromosome 13 in the human, and encodes the type 1single-pass transmembrane glycoprotein located in the Golgi apparatus. Athough thereare some studies suggesting how Klotho affects intracellular molecular mechanisms, therole of this protein on the DNA double strand brekage (DSB) repair mechanisms, whichare also known to have an effect on the aging process, cannot be elucidate yet. In thisstudy, we aimed to investigate how Klotho affects the expression of some genes,especially known to work in the non-homologous end joint (NHEJ) repair, one of therepair mechanisms in the DNA DSB repair.In the study, the mouse hippocampal cell lines HT22 cells were used. First, theIC50 dose of Endosulfan, which is known to produce double-chain fracture in DNA,was determined. Then, using this dose the HT22 cells were treated in differentexperimental protocols, and finally RNA and protein isolation was performed in thosecells. From obtained total RNAs the cDNAs were generated, and then changes in theexpressions of the Ku70, Ku80 and DNA-PK genes were determined by RT-PCR.Changes in protein level were determined by Western Blotting methods. The resultsshowed that the expression levels of studied genes increased significantly only inendosulfan-treated cells, but was not increased in the cells which also treated withKlotho protein. These results suggest that Klotho minimizes the harmful effect ofEndosulfan and suppresses the NHEJ pathway. Thus, for the first time in the literature,the role of Klotho protein in the NHEJ repair pathway was investigated.