Ratlarda deneysel subaraknoid kanama ile oluşturulan serebral vazospazm etyopatogenezinde rol oynayan apopitozis ve lipid peroksidasyonunun önlenmesinde sildenafil`in rolü

Abstract

Subaraknoid kanama sonrası gelişen vazospazmın meydana gelişi ve oluşummekanizmaları ile ilgili yapılan klinik ve labaratuar çalışmalar neticesinde, bu patolojikdurumun multifaktöriyel ve içiçe girmiş bir çok biyokimyasal reaksiyonlar sonucundaoluştuğu düşünülmektedir.Ancak anevrizma rüptürü neticesinde subaraknoid alana olan kanamadaeritrositlerin hemolizi sonucunda ortaya çıkan oksihemoglobinin, vasküler ve nöronalyapılarda patolojik süreci başlatan bir çok reaksiyonda rol alması nedeniyle vazospazmınoluşumuna neden olan en önemli faktörlerden biri olduğu kabul edilmektedir. Bununlaberaber hemoglobine olan affinitesi oksijenden 1000 kat daha fazla olduğu tespit edilenNitrik oksid adlı moleküler yapının keşfiyle beraber, SAK sonrası miktarının azalmasının,vazospazm gelişiminde çok önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir(1).Oksihemoglobinin ve diğer kan hücrelerinin kanama sahasında başlattığı inflamasyon,serbest radikal üretimi, lipid peroksidasyonu ve apopitoz, vasküler yapılarda vazospazmaneden olarak damarsal yapıların konstrikte olmasına ve nöronal ve vasküler yapılarıniskemiye girmesine neden olmaktadır. Vasküler endotelyal hücrelerde olan bu hasar veserbest radikal üretimi nedeniyle NO'in hem yapımı azalmakta hemde varolan NOtüketilerek damarlar konstrikte olmaktadır. Bu amaçla vazodilatatör, antienflamatuar,antioksidan ve serebral kan akımı regülasyon özellikleri olan NO'in miktarınınarttırılmasının vazospazmda iyi bir tedavi seçeneği olacağını düşündük. Bu amaçlafosfodiesteraz V inhibitör etkisi ile NO-cGMP yolağının artımına neden olan, klinikteerektil disfonksiyon ve pulmoner hipertansiyon tedavisinde kullanılan sildenafil sitratınvazospazm tedavisindeki etkilerini araştırmak amacıyla deneysel çalışmamızıgerçekleştirdik.Bu çalışmada 7 adet Sprague-Dawley cinsi ağırlıkları 245-550 gr arası olan erkekratlardan oluşan 4 grup oluşturuldu. Grup 1'de yer alan ratlara hiç bir işlem uygulanmadansakrifikasyon uygulandı. Grup 2'de yer alan ratların sisterna magnalarına 0.4 cc/kg'aotolog arteryal kan verilerek deneysel subaraknoid kanama oluşturuldu. Grup 3'te yer alanratlara aynı şekilde subaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 5mg/kg/gün sildenafil oral olarak verildi. Grup 4'te yer alan ratlarada aynı usulde deneyselvsubaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 15 mg/kg/gün sildenafil oralverildi. Deneyde, östrojenin iskemide eksitoksisiteyi, glutamat reseptör etkinliğini veimmun enflamasyonu azaltarak akson myelinizasyonunu sinaptogenezisi ve dendritikdallanmayı arttırarak nöroprotektif etki göstermesi nedeniyle erkek rat kullanıldı(2).Subaraknoid kanama yapılan tüm ratlar 48.saatte sakrifiye edildi. Tüm ratlarınbaziller arterlerinden 3'er kesit alınarak baziller arterin çapı freeware imaj analiz sistemleri(ImageJ, version 1.341; National Institutes of Health, Bethesda, MD) bilgisayar programıile ölçüldü. Lipid peroksidasyon değerleri için baziller arterin beslediği serebellumdanörnekler alındı ve tiyo barbitürik asit yöntemi ile nmolTBA/g yaş doku olarak hesaplandı.Gruplardaki baziller arter kesitlerindeki apopitozu göstermek amacıyla In Situ CellDetection Kit, POD (Roche, Germany) kullanıldı. Apopitotik indeks immünreaktifnukleusların total endotel hücre sayısına oranı ile hesaplandı. Sonuçlar yüzde olarak ifadeedildi. Buna göre boyanma saptanmayan kesitler Grade 0, %0-24 oranında apopitoz Grade1, %25-49 arasındakiler Grade 2, %50-74 arasındakiler Grade 3 ve %75-100 oranındaarteriyal apopitotik hücre boyanması gösterenler Grade 4 olarak ifade edildi. In Situ CellDetection Kit ile yapılan çalışmalarda apopitotik hücrelerle beraber nekrotik hücrelerde deTUNEL reaksiyonunun yanlış pozitif reaksiyona neden olmasından dolayı kaspaz 3,kaspaz 8, p53 ve sitokrom c adlı apopitotik markerlarda çalışılmıştır(3). Çalışmamızdasitokrom c'yi apopitotik mitokondriyal yolağı, kaspaz 8'i kaspaz bağımlı yolağı, kaspaz3'ü kaspaz bağımlı ve bağımsız yolun ortak ürünü, p53'ü ise tüm apopitotik sürecin enönemli markerı olduğu için kullandık(100,101).Buna göre SAK grubundaki ratların baziller arterler kesit alanlarının kontrolgrubuna göre %57 oranında daraldığı, sildenafil 5mg/kg/gün verilen grupta ise daralmanınkontrol grubu olan grup 1'e göre %16.8 olduğu tespit edildi. Sildenafil 15 mg/kg/günverilen grupta ise bu daralmanın %7.1 olduğu görüldü. Elde edilen kesit alanları istatikselaçıdan Post Hoc Tukey testi ile karşılaştırıldığında sildenafilin vazospazma karşı koruyucuetkisinin olduğu saptandı (p<0.0001). Lipid peroksid değerlerine bakıldığında SAKoluşturulan Grup 2'deki lipid peroksid değerinin kontrol grubu olan grup 1'e göre belirginolarak arttığı görüldü. Tedavi gruplarındaki lipid peroksid miktarlarının grup 2'dekideğerlere göre anlamlı derecede azaldığı tespit edildi (p<0.0001). Gruplardaki In Situ CellDetection Kit (POD (Roche, Germany) ile yapılan immunohistokimyasal boyama yöntemiile apopitotik hücre oranlarına baktığımızda grup 2, 3 ve 4'teki apopitotik hücreyüzdelerinin sırasıyla %88, %83 ve %81 olduğu, kontrol grubundaki apopitotik hücreviyüzdesinin %0 olduğu saptandı. Kaspaz 3, kaspaz 8, sitokrom c ve p53 ile yapılanincelemede herhangi bir işlem yapılmayan kontrol grubu grup 1de endotelyal hücrelerdeapopitotik bir boyanma saptanmazken, tedavi grupları ile SAK grubu arasında apopitotikendotelyal hücreler incelendiğinde herhangi bir fark saptanmadı. Tedavi gruplarınınapopitoz üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü.Sonuçlar dahilinde sildenafilin vazospastik damarlar üzerindeki iyileştirici etkisi velipid peroksidasyonunu önlemedeki anlamlı sonuçları nedeniyle yakın gelecektevazospazm tedavisinde yer alabilecek bir ilaç olduğuna inanıyoruz. Apopitozuengellemenin vazospazm oluşumunu engellemeyeceğini, vasküler ve nöronal hücrelericanlı tutmada yeterli olmadığını, tedavinin amacının ve asıl önem verilmesi gerekenkonunun kan pıhtısının kimyasal reaksiyonlarını engellemek, lipid peroksidasyonoluşumunu önlemek ve NO miktarını arttırmak olduğunu düşünüyoruz.Anahtar kelimeler: Subaraknoid kanama, Vazospazm, apopitoz, lipidperoksidasyonu, sildenafil.

After fulfilling many clinical and experimental studies about the mechanism ofcerebral vasospasm following subarachnoidal hemorrhage, it is thought that thispathologic disease to become after many connecting reactions and it is multifactorial.It is widely accepted that oxyhemoglobine, appearing following hemolysis oferythrocytes in the subarachnoidal space as a result of bleeding after rupture of ananeurysm, is the most important factor in the pathogenesis of vasospasm because of actingin many reactions causing the pathological process against the vascular and neuronaltissues. However since the discovery that nitric oxide, an endothelial derived relaxingfactor has 1000 times higher affinity for hemoglobin than oxygen, it is put forward thatdecreased NO availibility following SAH is one of the most important factor invasospasm(1). Vasoconstriction, vasospasm of the vessels and ischemia in the neurons andvascular tissue cells is the cause of inflammation, free radical production, lipidperoxidation and apoptosis developing after oxyhemoglobin and other blood products.Because of the damage in the vascular endothelial cells and production of free radicals,either decreasing NO availibility or running out of the present NO, cause of conctriction ofthe vessels. As we take into consideration of decreased levels of NO and antiinflamatuar,vasodilatation, antioxidan and cerebral blood flow regulation effect of NO; we thought thatincreasing the amount of NO availibility would be a good option in the treatment ofvasospasm. We carried out our experimental study aiming at searching out the effect ofsildenafil citrate PDE V inhibitor on cerebral vasospasm, which are currently approved forthe treatment of erectil dysfunction and pulmonary hypertension by increasing NO-cGMPpathway.In this study 7 male Sprague-Dawley rats weighting between 245-550 grams weregrouped into 4 groups. In group 2 ,3 and 4 the cisterna magna was aseptically puncturedwith a needle and 0.5 ml/kg of autologous arterial blood obtained by directly puncturingthe femoral artery was slowly injected intracisternally. Group 1 (Control) rats weresacrificed and submitted to biochemical study without surgical manipulation. Group 3 andgroup 4 after administering the blood intracisternally, received 5 mg/kg and 15 mg/kgsildenafil respectively for 2 days, respectively. Estrogen has a neuroprotective effect bydecreasing excitotoxicity, glutamate receptor activity and immun inflamation and byviiiincreasing axonal myelinization, synaptogenesis and dendtritic branch so that we usedmale rats in the experiment.All rats were decapitated following sacrification using high dose anesthetic agenton the second day. The rats basillary artery were sectioned from three seperate zones andthree sections were obtained from each rat. Basillary artery luminal sectional areas weremeasured using freeware computerized image-analyse systems (ImageJ, version 1.341;National Institutes of Health, Bethesda, MD). For lipid peroxidation study cerebellumsection samples from the rats fed by basillary artery were taken. The concentration of lipidpreoxides was measured by thiobarbituric acid test. Immunohistology using the ApopTagPeroxidase In Situ Apoptosis Cell Detection Kit, POD (Roche, Germany) was used todemonstrate apoptosis in a cross section of basillary artery. Apoptotic index was calculatedas the number of the immunoreactive nuclei per total number of endothelial cells,expressed as a percentage. No positive staining of endothelial cells with the ApopTag havebeen expressed as Grade 0, 0-24% immunostaining of endothelial cells as Grade 1, 25-49%as Grade 2, 50-74% as Grade 3, 75-100% immunostaining of endothelial cells have beenexpressed by Grade 4. Considering possible false positive results in TUNEL reaction innecrotic cells, each section was immunostained using for p53 (Clone Pab 240, mousemonoclonal antibody, NeoMarkers), caspase 3 (CPP32, NeoMarkers), caspase 8 (FLICE,NeoMarkers) and cytochrome c (Clone 7H8.2C12, mouse monoclonal antibody,NeoMarkers). Under light microscope examination, the positivity for all of theseantibodies was calculated as positive and negative in the endothelial cells of basillaryartery. In our atudy we used cytochrome c, representing the apoptotic mithocondrialpathway; caspase 8 respresenting the caspase dependent pathway, caspase 3 representingthe both caspase dependent and independent pathway and p53 playing the essential role inthe whole apoptotic cascade.In the SAH group(Group 2) the basillary artery circumferences constriction ratewas 61.7% compared with the control group (Group 1). In the SC (5mg/kg)-treated SAHgroup, the basillary artery circumference contriction rate was 16.8% and in the SC-treated15mg/kg SAH group this rate was 7.1% compared with the control group (Group 1). Forthe comparison of the effect of SC treatment after SAH, a Post Hoc Tukey test wasperformed between the groups. P value was less than 0.05 was considered significant. Theresults of group 1 between group 2, group 1 between group 3 and group 1 between group 4ixwas regarded as statistically significant (p<0.0001). As we take a look at the lipid peroxideresults , lipid peroxide values in SAH group (group 2) was significantly higher comparedwith gruop 1(p<0.0001). the lipid peroxide values in the treatment groups (group 3 andgroup 4) was significantly decreased compared with group 2 (p<0.0001). We observed thatsildenafil has prevented lipid peroxidation. The apoptotic cells rate, the immunostainingwith In Situ Cell Detection Kit (POD (Roche, Germany)in the groups were 0%, 88%, 83%and 81%, respectively. With the immunostaining using for p53, caspase 3, caspase 8 andcytochrome c, there was no actual apoptotic nuclei in group 1. In group 2, 3 and 4 therewas no significant difference in the number of apoptotic nuclei among these groups. Inconclusion no preventing effect of sildenafil has been detected against apoptosis.In conclusion, we believe sildenafil will take a part in the treatment of vasospasmin the future because of improving effect on the vessels and preventing effect of lipidperoxidation. We think that impeding apoptosis is not enough to cure vasospasm and notenough to keep the cells alive; the main aim of the treatment and the most important issueis to hinder the chemical reactions of the blood cells in the subarachnoid region and lipidperoxidation and to increase NO availibility.Key Words: Subarachnoidal hemorrhage, Vasospasm, apoptosis, lipidperoxidation, sildenafil.