Sıçanlarda postnatal ilk bir aylık dönemde nukleus olivaris inferiordeki gelişimin stereolojik metodlarla araştırılması

Abstract

Nukleus olivaris inferior (NOİ) beyin sapındaki en karakteristik ve dikkat çekici nukleus yapısıdır ve beyincikteki tırmanıcı liflerin de tek kaynağını oluşturur. Olivoserebellar yolların merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde ender raslanan ilginç anatomik yerleşimleri, bu sistemi kaynak ve hedef hücre ilişkilerinin çalışılması için oldukça elverişli kılar. Bu nedenle; NOİ'deki nöronların postnatal gelişimlerine ait bilgiler, hem olivoserebellar fonksiyonların yapısal temeUerinin hem de kaynak ve hedef hücre ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacak önemli bir adım teşkil edecektir. Her ne kadar NOİ'deki nöronların postnatal gelişimlerine ait daha önceleri yapılan çalışmalar burada nöron ölümü olduğunu tespit etmişlerse de, kullandıkları sayım metotları varsayımlara dayanan taraflı özellikte olduklarından güvenirlikleri tartışmaya açıktır. Sunulan çalışma, NOİ'deki bu gelişimin optik fraksiyonlama adı verilen modern, tarafsız ve varsayımlara dayanmayan bir sayım metodu ile araştırılması ve bu bölge çalışmaları için optimum bir örnekleme şeklinin tespit edilmesi amacıyla planlandı. Çalışmada 30 adet albino erkek sıçan kullanıldı. Bunlar, her grupta 5 hayvan olmak üzere postnatal (?) Pl, P5, P10, P15, P20 ve P30 günlük gruplar halinde çalışmaya alındı. P10 günlüğe kadar olan sıçanlar eter, daha sonraki gruplar ise üretan (1.25 gr/kg) anestezisi altında intrakardiak olarak %10'luk nötral formalin ile perfuzyona alındılar. Beyin saplan kafatasından çıkarıldıktan sonra parafine gömüldü. Her doku bloğunda yer alan NOİ tamamen bitene kadar, 40um kalınlığında koronal kesitler alındı. Bir ile 7 arasında rasgele bir sayı seçildikten sonra, ilk kesit bu sıradaki olmak üzere daha sonra her yedinci kesit alınarak cresyl violet ile boyandı. NOİ'nun yer aldığı kesitlerde, yine sistematik rasgele örnekleme ile elde edilen görüntü alanlarının ve kesit kalınlığının belirli fraksiyonlarında optik disektörler ile nöron sayımı yapıldı. Bu örnekleme fraksiyonları çalışma öncesinde yapılan bir pilot araştırma sonunda elde edildi. Herbir NOİ'deki toplam nöron sayısı, 112sayılan toplam nöron sayısının bütün örnekleme fraksiyonlarının tersi ile çarpımından elde edildi. Pl günlük hayvanların sağ ve sol NOİ 'lerinde hesaplanan toplam nöron sayısı sırasıyla 37335 ve 36978 olarak bulundu. P5 günlük sıçanlarda bu değerler %33'lük (P<0.05) bir düşüş gösterirlerken; P5, P10, P15, P20 ve P30 günlük gruplar arasındaki değerlerde anlamlı bir farklılık gözlenmedi (sağ taraf değerleri - ortalama ± SEM- P5 = 28003 ± 655, P10 = 27761 ± 1041, P 15 =26960 ±874, P20 = 26611 ±971, P30 = 26570 ± 708; sol taraf değerleri, - ortalama ± SEM- P5=28310±708, P10 = 27135 ± 934, P 15 = 27271 ± 987, P20 = 26877 ± 1090, P30 = 25987 ±847). Sağ ve sol taraftaki NOİ değerleri arasında da hiç bir yaş grubunda anlamlı farklılıklar gözlenmedi. Bu sonuçlar, sıçan NOİ'ünde postnatal ilk bir kaç günlük dönemde nöronal hücre kaybının varlığını göstermekle, daha önceleri yapılan çalışmaların sonuçlarım kısmen doğrulamaktadır. Bu bulgular ayrıca şu gerçeği de tekrar ortaya koymaktadır: Her ne kadar taraflı sayım metotları arasıra da olsa tarafsız sonuçlar verse de, bu sonuçların geçerliliği tarafsız stereolojik sayım metotları ile doğrulanmadan önce bilinememektedir. Çalışmada ayrıca, sıçan NOİ'ünde ileride yapılacak nöron sayımı çalışmaları için tespit edilen optimum örnekleme şeklinin hangi esaslara göre yapıldığı açıklanmıştır. 113

The inferior olivary nucleus (ION) is the most characteristic and striking nuclear structure in the medulla and the only source of climbing fibers projecting to the cerebellum. Because of the peculiar anatomical organization of the olivocerebellar pathway, this system offers a unique chance to study source and target cell relationships. Knowledge on the postnatal development of the neuronal population of the ION represents, therefore, an especially valuable first step toward a better understanding of the structural basis of olivocerebellar functions as well as source and target cell relationships. Although previous studies on the development of the cell population in the ION have demonstrated neuronal cell loss, the methods used are biased and are therefore subject to criticism. The presented study was designed to investigate this event with a contemporary, unbiased and assumption-free counting method, namely the optical fractionator and provide an optimum sampling scheme. A total of 30 male albino rats were used in the following postnatal (P) age groups (5 animals in each): PI, P5, P10, P15, P20, P30. Animals were anaesthetized either with ether vapour (for ages until P10) or urethane (1.25 g/kg) (for ages above P10) and killed by intracardiac perfusion with 10% neutral-buffered formalin. The brainstems were dissected out and embedded in paraffin. The ION in each block was cut exhaustively in the coronal plane with a microtome setting of 40um. After randomly selecting the first section within the first interval (between 1 and 7), every 7th section was collected. Sections were stained with cresyl violet. In each section containing the ION, neuron counts were made with optical disectors in a known 114fraction of the section thickness at predetermined area steps, again sampled in a systematic random fashion. This sampling fraction was determined from a pilot study. The total number of neurons in each ION was estimated by multiplying the total counted neurons by the inverse of each sampling fraction. The total number of the right and left ION neurons in the PI day-old animals were estimated to be 37335 and 36978, respectively. These numbers showed a decrease of 33% (PO.05) in P5 day-old rats, but no significant changes were observed among P5, P10, P15, P20 and P30 day-old groups (right side mean ± SEM of P5 = 28003 ± 655, P10 = 27761 ± 1041, P15 = 26960 ± 874, P20 = 26611 ± 971, P30 = 26570 ± 708; left side mean ± SEM of P5 = 283 10 ± 708, P10 = 27135 ± 934, P15= 27271 ±987, P20 = 26877 ± 1090, P30 = 25987 ± 847). No significant differences between left and right olives were noted at any stage. These results indicate neuronal cell loss during the first few postnatal days of the rat ION development confirming in part previously made biased observations. These results also show that although biased counting methods can sometimes give unbiased estimates, one does not know that this is true before confirming it with unbiased stereological counting methods. The rationale for an optimized sampling scheme for studies of the number of neurons in the rat ION is described. 115