Echinocococcus granulorus hidatik kistlerinde oksidantların (ROÜ, RNÜ) etkinliği ve antioksidant sistemlerin araştırılması

Abstract

IV ÖZET Echinococcus granulosus HİDATİK KİSTLERİNDE OKSİ DAN L ARIN (ROÜ, RNÜ) ETKİNLİĞİ VE ANTİOKSİDAN SİSTEMLERİN ARAŞTIRILMASI Ramazan AMANVERMEZ, Doktora Tezi Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Samsun, Ekim 1997 Hidatik kistler biyokimyasal açıdan birçok yönleriyle araştırılmış olmasına rağmen, fertil ve infertil hidatik kistlerde oksidanlann (serbest radikaller; reaktif oksijen ürünleri (ROÜ) ve reaktif nitrojen ürünleri (RNÜ)) etkinliği ve antioksidan sistemler hakkındaki bilgiler yeterli düzeyde değildir. Yapılan bu çalışmada, hidatik kist enfeksiyonunda konak fagositer hücrelerce ve parazit (olasılıkla) tarafindan üretilen serbest radikallerin; koyun ve sığır fertil hidatik kist (karaciğer, akciğer) ve sığır infertil hidatik kist (karaciğer, akciğer) sıvılarında ve kist dokularında (kist membranlan ve protoskoleksler) oluşturduğu hasarın boyutunu tesbit etmek amacı ile lipid peroksit (tbars) düzeyleri ölçülerek; kist hidatik'in serbest radikal- aracılı lipid peroksidasyonu, hidatik kist sıvılarında ve kist dokularında NO (nitrik oksit) düzeyi tayin edilerek; NO'in hidatik kişilerdeki sitotoksik konumu incelendi. Bununla birlikte hidatik kistlerde süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (Gpx) ve katalaz'ın (enzimatik antioksidanlar); kist membranlarmda, protoskolekslerde ve kist sıvılarında aktivite düzeyleri ve total antioksidan, total tiol, glutatyon, vitamin C, vitamin E ve 0-karoten'in (non-enzimatik antioksidanlar) fertil ve infertil hidatik kist sıvılarında, total antioksidan protoskolekslerde ve total tiol ile glutatyon kist membranlarmda ve protoskolekslerde tayin edilerek; hidatik kist ile antioksidanlar arasındaki ilişki, özellikle hidatik kistlerin fertilitesi ve infertilitesinde oksidanlara karşı hidatik kistlerin enzimatik ve non-enzimatik antioksidan defans mekanizmaları aydınlatılmaya çalışıldı. SOD, Gpx ve katalaz aktiviteleri ile total antioksidan, total tiol, vitamin C, vitamin E, P-karoten ve NO (nitrit + nitrat) tayinlerinde spektrofotometrik yöntemler, redükte glutatyon ve lipid peroksit (tbars) tayinlerinde ise florometrik yöntemler kullanıldı.Hidatik kist'in serbest radikal-aracılı lipid peroksidasyonunu ifade etmek için fertil ve infertil kist sıvılannda, kist membranlannda ve protoskolekslerde tayin edilen lipid peroksit düzeylerinin istatistiksel karşılaştınlmasmda; fertil hidatik kist sıvılannda (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 0.84 ± 0.14, 0.90 ± 0.12 umol/L), infertil kist sıvılarına (sığır karaciğer ve akciğer sırasıyla; 0.29 ± 0.07, 0.2 + 0.06 umol/L) göre yüksek lipid peroksit düzeyleri tesbit edilirken (P< 0.05), fertil (koyun karaciğer ve akciğer kist membranlan sırasıyla; 0.71 ± 0.12, 0.74 ± 0.27 nmol/mg yaş doku proteini) ve infertil hidatik kist membranlannda (sığır karaciğer ve akciğer sırasıyla; 0.37 ±0.11, 0.39 ± 0. 1 5 nmol/mg yaş doku proteini) ölçülen lipid peroksit düzeyleri arasında ise anlamlı bir farkhlık görülmedi (P> 0.05). Ancak protoskolekslerde (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 1.99 ± 0.45, 2.07 ± 0.20 nmol/mg yaş doku proteini) ölçülen lipid peroksit düzeyleri koyun fertil kist membranlanna göre anlamlı (P< 0.05) ve özellikle infertil kist membranlanna göre ileri derecede anlamlı olarak yüksek bulundu (P< 0.01). RNÜ (NO)'nin hidatik kistlerdeki sitotoksik konumunu değerlendirmek için fertil ve infertil hidatik kist sıvılannda, protoskolekslerde ve kist membranlannda tayin edilen NO düzeylerini karşılaştırdığımızda ise fertil kist sıvılannda (koyun ve sığır akciğer sırasıyla; 2.46 ± 0.94, 3.31 + 1.00 umol/L) NO düzeyleri infertil kist sıvılarına (akciğer; 1.09 ± 0.31 umol/L) nazaran anlamlı olarak yüksek bulundu (P< 0.05). Aynca infertil kist membranlannda (5.80 ± 2.27, 7.40 ± 2.47 nmol/mg yaş doku proteini) NO düzeyleri fertil kist membranlanna (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 1.81 ± 0.56, 1.68 ± 0.35 nmol/mg yaş doku proteini) kıyasla anlamlı olarak yüksek bulundu (P< 0.05). Parazit larvalarını içeren fertil kist sıvılannda (infertil kist sıvılarına göre) ve protoskolekslerde (fertil ve infertil kist membranlanna kıyasla) lipid peroksit düzeylerinin yüksek olması, NO düzeylerinin infertil kist sıvılarına göre fertil kist sıvılannda ve fertil kist membranlanna kıyasla, infertil kist membranlannda anlamlı olarak yüksek bulunması; hidatik kist fertikte ve infertilitesinde ROÜ ve RNÜ'nin sitotoksik katkısının olabileceğini düşündürmektedir. Fertil hidatik kist sıvılannda Gpx, SOD ve katalaz aktivitelerinin bulunmasına karşın, infertil hidatik kist sıvılannda enzimatik antioksidan aktiviteleri ölçülemedi. Aynca infertil hidatik kist membranlannda Gpx aktivitesi olmamasına rağmen fertil ve infertil kist membranlannda, protoskolekslerde; SOD ve katalaz aktiviteleri, fertil hidatik kistVI membranlannda ve protoskolekslerde de Gpx aktivitesi ölçüldü, özellikle koyun fertil hidatik kist membranlannda (karaciğer, akciğer sırasıyla SOD; 1.76 ± 0.66, 1.50 ± 0.49 ve katalaz; 5.19 ± 3.02, 2.97 ± 0.97 U/mg yaş doku proteini/dk), sığır infertil hidatik kist membranlanna (karaciğer, akciğer sırasıyla SOD; 0.15 ± 0.05, 0.12 ± 0.02 ve katalaz; 0.52 ±0.18, 0.47 ±0.17 U/mg yaş doku proteini/dk) göre anlamlı olarak yüksek düzeyde SOD ve katalaz aktivitelerine (P< 0.01), protoskolekslerde de (koyun karaciğer ve akciğer hidatik kist protoskoleksleri sırasıyla Gpx; 2.26 ± 0.62, 2.13 ± 0.62 U/g yaş doku proteini/dk, SOD; 0.80 ± 0.23, 0.95 ± 0.15 ve katalaz; 2.03 ± 0.65, 2.48 ± 1.27 U/mg yaş doku proteini/dk ile sığır karaciğer ve akciğer hidatik kist protoskoleksleri sırasıyla Gpx; 0.87 ± 0.03, 1.33 ± 0.59 U/g yaş doku proteini/dk, SOD; 1.09 ± 0.70, 0.82 ± 0.10 ve katalaz; 1.53 ± 0.11, 1.56 ± 0.36 U/mg yaş doku proteini/dk), sığır infertil hidatik kist membranlanna (karaciğer, akciğer sırasıyla Gpx; 0.00 ± 0.00, 0.00 ± 0.00 U/g yaş doku proteini/dk, SOD; 0.15 ± 0.05, 0.12 ± 0.02 ve katalaz; 0.52 ± 0.18, 0.47 ± 0.17 U/mg yaş doku proteini/dk) kıyasla anlamlı derecede yüksek (P< 0.01) SOD, katalaz ve Gpx aktivitelerine rastlanmıştır. özellikle fertil hidatik kist membranlannda, fertil hidatik kist sıvılannda ve protoskolekslerde enzimatik antioksidanlann bulunması; muhtemelen serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı hidatik kist larvalarının ve kistin doğurgan tabakalarının (germinal membran) antioksidan savunmasında rol alabileceğine işaret etmektedir. Fertil ve infertil hidatik kist sıvılannda, kist membranlannda ve protoskolekslerde ölçülen non-enzimatik antioksidanlann istatistiksel karşılaştırılmasında; total antioksidan, total tiol, glutatyon ve vitamin C düzeylerinin infertil kist sıvılanna (karaciğer ve akciğer sırasıyla total antioksidan; 0.80 ± 0.13, 0.87 ± 0.13 mmol/L, total tiol; 14.7 ± 1.58, 16.9 ± 3.82 umol/L, glutatyon; 3.03 ± 0.30, 3.02 ± 0.18 umol/L, vitamin C; 0.08 ± 0.01, 0.09 ± 0.01 mg/dl ve vitamin E; 226 ± 22, 225 ± 17 ug/dl) göre fertil kist sıvılannda (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla total antioksidan; 1.42 ± 0.52, 1.21 ± 0.09 mmol/L, total tiol; 31.6 ± 3.7, 28.0 ± 3.9 umol/L, glutatyon; 7.21 ± 1.03, 6.96 ± 0.80 umol/L, vitamin C; 0.43 ± 0.08, 0.32 ± 0.04 mg/dl) anlamlı olarak yüksek (P< 0.05), vitamin E'nin ise anlamlı olarak fertil kist sıvılannda (karaciğer ve akciğer sırasıyla; 165 ± 40, 166 ± 34 Ug/dl) düşük olduğu görüldü (P< 0.05). Bununla birlikte fertil (koyun karaciğer ve akciğer hidatik kist membranlan sırasıyla total tiol; 61.78 ± 5.49, 58.07 ± 8.42 nmol/mgvıı yaş doku proteini, glutatyon; 5.51 + 0.90, 6.05 ± 0.49 nmoî/mg yaş doku proteini) ve infertil kist membranlannda (karaciğer ve akciğer sırasıyla total tiol; 45.07 ± 8.44, 47.95 ± 5.25 nmol/mg yaş doku proteini, glutatyon; 4.58 ± 0.64, 4.38 + 1.10 nmol/mg yaş doku proteini) tayin edilen total tiol ve glutatyon ile protoskolekslerde tayin edilen total antioksidan (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 6.63 ± 0.45, 6.75 ± 0.68 umol/mg yaş doku proteini), total tiol (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 46.20 ± 9.60, 45.79 ± 9.40 nmol/mg yaş doku proteini) ve glutatyon (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 3.30 ± 0.41, 3.26 + 0.43 nmol/mg yaş doku proteini) düzeylerinin fertil ve infertil hidatik kist membranlan ve protoskoleksler arasında anlamlı bir farklılık göstermediği tesbit edildi (P> 0.05). Fertil (koyun karaciğer ve akciğer sırasıyla; 43.4 ± 2.9, 42.9 ± 5.3 ug/dl) ve infertil (karaciğer ve akciğer sırasıyla; 39.6 ± 2. 1, 40.1 ± 1.4 ug/dl) hidatik kist sıvılarında tayin edilen (3-karoten düzeyleri arasında da anlamlı bir farklılık bulunamadı (P> 0.05). Total antioksidan, total tiol, glutatyon ve vitamin C'nin fertil hidatik kist sıvılarında yüksek, vitamin E'nin ise düşük bulunması fertil kistlerde kist germinal membranın ve protoskolekslerin, memelilere benzer şekilde oksidan ajanlara karşı korunmaları ve metabolik fonksiyonları için, araştırılan non-enzimatik antioksidanlara gereksinim duyabileceklerini düşündürmektedir. Fertil ve infertil hidatik kistlerde araştırılan antioksidan moleküllerin, özellikle fertil kistlerde potansiyel olarak bulundukları görülmektedir. Bununla birlikte hidatik kist enfeksiyonu süresince serbest radikallerin ve konağın diğer savunma elemanlarıyla birlikte hidatik kist viabilitesini etkileyebileceklerinden, hidatik kistlerin fertil ve steril özellik kazanmalarında bir farklılığa neden olabilirler.

vm ABSTRACT THE EFFECTIVENESS OF OXIDANTS (ROI, RNI) IN Echinococcus granulosus HYDATID CYSTS AND AN INVESTIGATION OF THEIR ANTIOXIDANT SYSTEMS Ramazan AMANVERMEZ, Ph.D.Thesis University of Ondokuz Mayıs, Samsun, October 1997 Although the hydatid cysts have been investigated in many aspects with respect to biochemical view, there were no enough knowledge about the effectiveness of oxidants (free radicals; including reactive oxygen intermediates (ROI) and reactive nitrogen intermediates (RNI)) at fertile and infertile hydatid cysts, and antioxidant systems. In this study, free radical-mediated lipid peroxidation was investigated by measuring lipid peroxide (TBARS) levels with the aim of determining of the extent of the damage caused by free radicals, produced by host phagocytes cells in hydatid cyst infection and parasit's (if possible) at hydatid cyst (sheep and cattle fertile hydatid cyst; liver, lung and cattle infertile hydatid cyst; liver, lung) fluids and cyst tissues (cyst membranes and protoscoleces). Cytotoxic state of NO in hydatid cysts was also investigated by determining of the NO (nitric oxide) levels in hydatid cyst fluids and cyst tissues. Furtermore, the relationship between hydatid cysts and antioxidants was investigated by determining of the superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (Gpx) and catalase (enzymatic antioxidants), and total antioxidant, total thiol and reduced glutathione levels at cyst membranes, protoscoleces and cyst fluids. In addition, total antioxidant, total tiol, reduced glutathione, vitamin C, vitamin E and 3-carotene (non-enzymatic antioxidants) levels were measured in fertile and infertile hydatid cyst fluids. However, it was aimed to lighten the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defence mechanisms of hydatid cysts against free radicals in the fertility and infertility of hydatid cysts.IX While SOD, Gpx and catalase enzyme activities and total antioxidant, total thiol, vitamin C, vitamin E, 0-carotene and NO (nitrite + nitrate) levels were determined by spectrophotometric methods, reduced glutathione and lipid peroxide levels were determined by flourometric methods. While the lipid peroxide levels in fertile hydatid cyst fluids (0.84 ± 0.14, 0.90 ± 0.12 umol/L for sheep liver and lung, respectively) were superior to those of infertile cyst fluids (0.29 ± 0.07, 0.20 ± 0.06 umol/L for cattle liver and lung, respectively) (P< 0.05), there were no significant differences between fertile (0.71 ± 0.12, 0.74 ± 0.27 nmol/mg wet tissue protein for sheep liver and lung cyst membranes, respectively) and infertile ng?stTnembranes^Q^7^tTÖ7İil7^9^ lung, respectively) with respect to lipid peroxide levels (P> 0.05). But, lipid peroxide levels measured at protoscoleces (1.99 ± 0.45, 2.07 ± 0.20 nmol/mg wet tissue protein for sheep liver and lung, respectively) were higher than those of sheep fertile cyst membranes (P< 0.05), and lipid peroxide levels also measured at sheep hydatid cyst, and it was found that protoscoleces were found superior to those of infertile cyst membranes (P< 0.01). In comparing of NO levels measured at fertile and infertile hydatid cyst fluids, protoscoleces and cyst membranes with the aim of evaluating the cytotoxic state of RNI (NO) in hydatid cysts, NO levels in fertile cyst fluids (2.46 ± 0.94, 3.31 ± 1.00 umol/L for sheep and cattle lung, respectively) were found higher than those of infertile cyst fluids (1.09 ± 0.31 umol/L for lung) (P< 0.05). Moreover, NO levels in infertile cyst membranes (5.80 ± 2.27, 7.40 + 2.47 nmol/mg wet tissue protein for liver and lung, respectively) were higher than those of fertile cyst membranes (1.81 ± 0.56, 1.68 ± 0.35 nmol/mg wet tissue protein for sheep liver and lung, respectively) (P< 0.05). The higher lipid peroxide levels in fertile cyst fluids consist in parasite larvas and protoscoleces, NO levels were also higher in fertile cyst fluids and infertile cyst membranes remind that ROI and RNI' s may have cytotoxic support on hydatid cyst fertility and infertility. Despite of absence of enzymatic antioxidant activity in infertile hydatid cyst fluids, there are Gpx, SOD and catalase activities in fertile hydatid cyst fluids. Also, while there were no Gpx activity in infertile hydatid cyst membranes, they were determined SOD andcatalase activities in fertile and infertile cyst membranes and protoscoleces. In addition, it was determined Gpx in fertil cyst membranes and protoscoleces. They were determined higher SOD and catalase activities in sheep fertile hydatid cyst membranes (SOD; 1.76 ± 0.66, 1.50 ± 0.49 and catalase; 5.19 ± 3.02, 2.97 ± 0.97 U/mg wet tissue protein/min for liver and lung, respectively) than cattle infertile hydatid cyst membranes (SOD; 0.15 ± 0.05, 0.12 ± 0.02 and catalase; 0.52 ± 0.18, 0.47 ± 0.17 U/mg wet tissue protein/min for liver and lung, respectively) (P< 0.01). However, they were higher Gpx, SOD and catalase activities in protoscoleces (Gpx; 2.26 ± 0.62, 2.13 ± 0.62 U/g wet tissue protein/min, SOD; 0.80 ± 0.23, 0.95 ± 0.15 and catalase; 2.03 ± 0.65, 2.48 ± 1.27 U/mg 0.87 ± 0.03, 1.33 ± 0.59 U/g wet tissue protein/min, SOD; 1.09 ± 0.70, 0.82 ± 0.10 and catalase; 1.53 ±0.11, 1.56 ± 0.36 U/mg wet tissue protein/min for cattle liver and lung hydatid cyst protoscoleces, respectively) than cattle infertile hydatid cyst membranes (Gpx; 0.00 ± 0.00, 0.00 ± 0.00 U/g wet tissue protein/min, SOD; 0.15 ± 0.05, 0.12 ± 0.02 and catalase; 0.52 ±0.18, 0.47 ±0.17 U/mg wet tissue protein/min for liver and lung, repectively) (P< 0.01). The presence of enzymatic antioxidants in cyst tissues, especially fertile hydatid cyst membranes, protoscoleces and fluids show that these enzymatic antioxidants have an important role in the antioxidant defence of hydatid cyst larvas (protoscoleces) and germinal membranes against the harmful effects of free radicals. While total antioxidant, total thiol, reduced glutathione and vitamin C levels were higher in fertile cyst fluids (total antioxidant; 1.42 ± 0.52, 1.21 ± 0.09 mmol/L, total tiol; 31.6 ± 3.7, 28.0 ± 3.9 umol/L, reduced glutathione; 7.21 ± 1.03, 6.96 ± 0.80 umol/L, vitamin C; 0.43 ± 0.08, 0.32 ± 0.04 mg/dl for sheep liver and lung, respectively) than those of infertile cyst fluids (total antioxidant; 0.80 ± 0.13, 0.87 ± 0.13 mmol/L, total thiol; 14.7 ± 1.58, 16.9 ± 3.82 umol/L, reduced glutathione; 3.03 ± 0.30, 3.02 ± 0.18 umol/L, vitamin C; 0.08 + 0.01, 0.09 ± 0.01 mg/dl and vitamin E; 226 ± 22, 225 ± 17 ug/dl for liver and lung, respectively) (P< 0.05), vitamin E levels were lower in fertile cyst fluids (165 ± 40, 166 ± 34 ug/dl for liver and lung, respectively) (P< 0.05). However, total thiol and reduced glutathione levels determined at fertile (total thiol; 61.78 ± 5.49, 58.07 ± 8.42 nmol /mg wet tissue protein, reduced glutathione; 5.51 ±XI 0.90, 6.05 ± 0.49 nmol/mg wet tissue protein for sheep liver and lung hydatid cyst membranes) and infertile cyst membranes (total thiol; 45.07 + 8.44, 47.95 ± 5.25 nmol/mg wet tissue protein, reduced glutathione; 4.58 ± 0.64, 4.38 ±1.10 nmol/mg wet tissue protein for liver and lung, respectively), and total antioxidant, total thiol and reduced glutathione levels determined at protoscoleces (total antioxidant; 6.63 ± 0.45, 6.75 ± 0.68 umol/wet tissue protein, total thiol; 46.20 ± 9.60, 45.79 ± 9.40 nmol/mg wet tissue protein, reduced glutathione; 3.30 ± 0.41, 3.26 + 0.43 nmol/mg tissue protein for sheep liver and lung hydatid cyst protoscoleces, respectively) were not different among the cyst tissues (P> 0.05). Besides, there were no differences between fertile (43.4 ± 2.9, ^4279^^T3~7^g/dHOT^heep^Kver^n^ 1.4 ug/dl for liver and lung, respectively) hydatid cyst fluids in terms of P-earotene levels (P> 0.05). The higher total antioxidant, total thiol, reduced glutathione and vitamin C levels, and low vitamin E levels in fertile hydatid cyst fluids shows that cyst germinal membranes and protoscoleces need non-enzymatic antioxidants in order to defend against to oxidant agents and also, carry out metabolic functions as in mammals. It was found that antioxidant molecules in fertile hydatid cysts was higher than those level of antioxidants infertile hydatid cysts. However, as free radicals and the other host defence elements can affect hydatid cyst viability along the hydatid cyst infection, and they may cause a difference at fertility and sterility properties to win of hydatid cysts.