Iskemiye ikincil damarlanma esnasında çentık sinyal yolagının rolü

Abstract

Embriyonik dönemi takiben yeni damar olusumu, dinamik bir islem oluporganizmanın metabolik, immünolojik ve büyüme gereksinimlerine cevap verecekbiçimde gerçeklesmektedir. Dogum sonrası dönemde, yeni damar olusumu için enönemli uyaranın hipoksi oldugu düsünülmektedir. Çentik sinyal yolagı hücrelerarası iletisimi saglayarak, hücrelerin büyümesi, farklılasması ve özellesmesiaçısından önemli bir role sahiptir. Islevsel bir Çentik sinyal yolagı, normal damargelisimi açısından gereklidir. Embriyonik dönemde damarın arter veya venyönünde farklılasmasını sagladıgı gibi, olusan damar agının islevselligi açısındandallanma isleminde dengeliyici bir rol üstlenmektedir. Bu denge, dallanandamarın en ucundaki endotel hücrelerinde sentezlenen DLL4 ile saglanmaktadır.Bu moleküller ana damar endoteli üzerindeki çentik reseptörleri ile etkilesimegirerek vascular endothelial growth factor receptor 2 sentezini baskılamaktadır.Böylece, vascular endothelial growth factor'un dallandırıcı etkisibaskılanmaktadır. Postembriyonik dönemde, Iskemiye ikincil gelisen damarlanmaesnasında Çentik sinyal yolagının etkisi halen bilinmemektedir. Bu çalısmada,sıçanda olusturulan iskemi modelinde Çentik sinyal yolagının etkili olup olmadıgısorusuna cevap aramaktayız.Çalısmada 30 adet erkek `Sprague Dawley` cinsi sıçan kullanıldı. Iskemimodeli olarak, sırt bölgesinde kaudal bazlı random paternli deri flebi (modifiyeMcFarlane flebi) tercih edildi. Sıçanlar 2 gruba ayrıldı. Grup I (kontrol grubu): bugrupta yer alan 6 sıçana herhangi bir cerrahi islem uygulanmadı. Cerrahi grubundakullanılan McFarlane flebinin distal kısmına denk gelen bölgeden doku biopsisiyapıldı. Kalp içinden kan örneklemesi yapıldıktan sonra sıçanlar sakrifiye edildi.Grup II (cerrahi grubu): Bu grupta yer alan 24 sıçandan McFarlane dorsal deriflebi kaldırıldı ve tekrar yerine dikildi. Doku ve kan örneklemeleri ilk 6 sıçandan55cerrahi sonrası 1. gün, ikinci 6 sıçandan cerrahi sonrası 3. gün, üçüncü 6 sıçandancerrahi sonrası 5. gün ve son 6 sıçandan cerrahi sonrası onuncu gün yapıldı.Örnekleme islemini takiben sıçanlar sakrifiye edildi. Alınan kan ve dokuörneklerinde incelenen parametreler: ELISA yöntemi ile kanda DLL4 ve VEGFseviyeleri, GZ - PZR yöntemi ile dokuda DLL4 ve VEGF ifadelenmesi veimmünohistokimyasal boyama yöntemleri ile dokuda DLL4 proteinin tayini.Kontrol grubuna ait iskemik olmayan doku ile karsılastırıldıgında, iskemikdokuda VEGF transkripsiyonunun cerrahi sonrası birinci gün %66 oranındaazaldıgı gözlenmistir. Cerrahi sonrası 3. gün bazal seviyelere tekrar ulastıktansonra, en yüksek seviyesine %40'lık artıs ile cerrahi sonrası besinci gün ulastıgınıgörmekteyiz. Cerrahi sonrası onuncu gün, ifadelenme bazal seviyeye göre %68azalmaktadır. Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.01) .DLL4 ifadelenmesine bakacak olursak, kontrol grubundan elde edilen düzeyleregöre iskemik dokuda DLL4 transkripsiyonunun cerrahi sonrası birinci gün % 63oranında azaldıgı gözlenmistir. Cerrahi sonrası 3. Gün %147, 5. Gün ise %172artıs saptanmıstır. Onuncu günde, bazal seviyelere göre %70 azalma saptanmıstır.Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.01) . Kanda ölçülenVEGF seviyelerinin ortalamalarına bakıldıgında; kontrol grubu: 0,09 pg/ml,cerrahi grubu I: 0,37 pg/ml, cerrahi grubu II: 0,63 pg/ml, cerrahi grubu III: 0,25pg/ml ve cerrahi grubu IV: 0,19 pg/ml olarak bulundu. Gruplar arası farkistatistiksel açıdan anlamlı bulunmustur ( p < 0.01). Kanda ölçülen DLL4seviyelerine bakıldıgında; cerrahi grubu I: 0,175 ng/ml ve cerrahi grubu II: 0,28ng/ml olarak bulundu. Cerrahi grubu III ve IV ile kontrol grubundan alınanörneklerde düsük seviyeye baglı olarak ölçüm yapılamadı. Gruplar arası farklılıkistatistiksel olarak anlamlı bulundu (p < 0.01). DLL4 antikoru ile yapılanimmünohistokimyasal boyamada, kontrol grubunda bazı endotelyal hücrelerdeminimal sitoplazmik granüler boyanma gözlendi. Cerrahi uygulanan gruplardakapiller proliferasyon alanlarında daha belirgin olmak üzere, endotelyalhücrelerde degisken siddetlerde yaygın pozitif reaksiyon gözlendi. Cerrahigrupları arası boyanma siddetinde farklılık gözlenmedi.Daha önce yapılan çalısmalarda, Çentik sinyal yolagının embriyo ve tümördamarlarlarında aktive oldugu gösterilmisti. Bu çalısmada, Çentik sinyal yolagınıniskemi ile tetiklenen damarlanma esnasında aktive oldugunu göstermekteyiz.

Postembriyonic neoangiogenesis is a dynamic process which correlateswith tissue's metabolic, immunologic and growth demands. The primary stimulusfor postembriyonic neoangiogenesis is thought to be ischemia. The Notchsignaling pathway is implicated in cell–cell communication, which is importantfor the control of cell growth, differentiation, and specification. Functional Notchsignaling is definitely required for normal vascular development, being part of thegenetic program that determines the arterial and venous endothelium identity. Inaddition, growing evidence supports the involvement of the Notch ligand Deltalike 4 in the regulation of sprouting angiogenesis in the embriyonic period. Thisprocess is reportedly modulated by Dll4 signals from tip endothelial cells toneighboring stalk endothelial cells to restrict the emergence of excessive sproutingthrough repression of vascular endothelial growth factor receptor 2 transcriptionand consequent reduction of responsiveness to vascular endothelial growth factor.Blockade of Notch signaling reportedly slows down tumor growth despite anincrease of tumor vasculature density because the established vascular network isfunctionally inefficient. However, the implication of Dll4 in reparativeneovascularization after ischemia remains unexplored. We investigated the role ofDll4/Notch signaling in ischemic conditions.The flap model was, 3X9 cm sized, caudally pedicled, random pattern skinflap on the back of rat (modified McFarlane flap). Thirty adult male Sprague-Dawley rats were used in this study. 2 groups were composed. Group I (controlgroup): 6 rats were included in this group. Dorsal skin biopsies were performedand blood samples were collected without any surgical procedure. Group II(surgery group): 24 rats were included in this grup. In all rats, dorsal skin flaps58were completely elevated and reinset. Flap biopsies were performed and bloodsamples were collected 24 hours, 3 days, 5 days and 10 days postsurgery. Tissuespecimens were assessed for DLL4 and VEGF gene expression by reversetranscription- polymerase chain reaction analysis (RT-PCR). Plasma levels ofVEGF and DLL4 were measured using ELISA. Immunohistochemical stainingwas used for detction of DLL4 in tissue materials.Compared with nonischemic tissue, there was a %66 decrease in VEGFtissue expressions in ischemic tissues during the first postoperative day. Normallevels were reached at third postoperative day. Maximum levels were measured atthe fifth postoperative day with an increase of %40. There was a %68 decrease atthe tenth postoperative day. The differences between groups were statisticallysignificant (P < 0.01). Compared with nonischemic tissue, there was a %63decrease in DLL4 tissue expression levels in ischemic tissues during the firstpostoperative day. There was a %147 and %172 increase during the third and fifthdays respectively. The differences between groups were statistically significant (P< 0.01). The mean of plasma levels for VEGF were as follows; control group:0,09 pg/ml, surgery group I: 0,37 pg/ml, surgery group II: 0,63 pg/ml, surgerygroup III: 0,25 pg/ml, surgery group IV: 0,19 pg/ml and control group: 0,09 pg/ml. The differences between groups were statistically significant (P < 0.01). Themean of plasma levels for DLL4 were as follows; Surgery group I: 0,175 ng/ml,surgery group II: 0.28 ng/ml, surgery groups III, IV and control group: notdetectable. The differences between groups were statistically significant (P <0.01). Imountimmunohistochemical analysis using specific anti-Dll4 antibodiesrevealed weak and patchy expression of Dll4 in microvascular ECs ofnormoperfused muscles. Conversely, Dll4 expression was upregulated in capillaryendothelial cells after ischemia.Previous studies reported Dll4 to be expressed in embryonic and tumorvasculature. In this study, we show the upregulation of the Notch ligand Dll4 inrat models of ischemia. As a result, we can suggest that the Notch pathway playsan important role during surgical delay in which ischemia-induced angiogenesis isstimulated. Therefore, therapeutic anti DLL4 could result in the increase ofadequately functional blood vessels.