İlaç dirençli Herpes simplex virus Tip-1 (HSV-1) mutantının elde edilmesi ve replikasyon kinetiğinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmanın amacı; İn vitro ortamda ribavirin (RBV) kullanılarak dirençli Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1) mutantı elde etmek ve saha suşunun RBV baskısı altındaki davranışları ile replikasyon kinetikleri arasındaki değişimleri incelemektir. Bu çalışmada, HSV-1 ile ilgili tüm süreçleri yürütmek amacı ile in vitro sistem olarak RD (insan rabdomiyosarkoması) ve Vero (Afrika yeşil maymun böbrek hücre hattı) kullanıldı. Çalışmanın ilk aşamasında ribavirinin hücreler için sitotoksik olmayan konsantrasyonu gerek tripan mavisi ve gerekse WST reaktifi ile tespit edildi. Bu aşamayı takiben, HSV-1 sitotoksik olmayan RBV dozu ile baskı altına alınarak ve baskı altına alınmadan üst üste 20 pasajlandı. Her pasaj için ilaç baskısı altında olan ve olmayan virusların titresi tespit edildi. Ayrıca her pasaj polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak (PCR) HSV-1 varlığı açısından kontrol edildi. Çalışmanın son aşamasında HSV-1 için iki spesifik gen bölgesi olan UL-23 ve UL-30 gen bölgelerinin varlıkları her pasaj için PCR yöntemi ile araştırıldı. RD ve Vero hücre kültürleri için RBV'in sitotoksik olmayan dozu 50 µM olarak tespit edildi. Birinci pasaj ile karşılaştırıldığında, ilaç baskısı altında olan virusun 20.pasaj titresinde 2 Log artışı vardı. İlaç baskısı altında olmayan virus için ise 14.pasajdan itibaren titre ve sitopatik değişiklikler (CPE) tespit edilemedi. Moleküler analizler sonucunda, UL-23 ve UL-30 gen bölgeleri ilaç baskısı altında olmayan HSV-1'de tespit edilemezken, iki gen bölgesinin ilaç baskısı altında bulunan HSV-1 için varlığı tespit edildi.

The aim of this study was to obtain a drug- resistant Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) mutant using ribavirin (RBV) in vitro and to investigate both the changes of replication kinetics and the behaviors of HSV-1 under RBV pressure.In this study, RD (human rhabdomyosarcoma) and Vero (Africa green monkey kidney) cell line were used in order to carry out all processes related to HSV-1, as in vitro system. In the first stage of the study, the non-cytotoxic concentration of ribavirin for cells was determined by using both trypan blue and WST reagents. Following this stage, 20 consecutive passages of HSV-1 were performed under the pressure of non-cytotoxic dose of RBV and also without drug pressure. For each passage, titers of viruses that was under drug pressure and was not under drug pressure were determined. Furthermore, each passage was also checked for the existence of HSV-1 presence using the polymerase chain reaction. At the last stage of this study, two specific genes regions of HSV-1 were investigated for each passage. The non-cytotoxic dose of RBV for both RD and Vero cell lines were determined to be 50 μM. There were 2 Log increase to the titer of 20 the passage as compared to the titer of first passage. Both CPE and titer could not be detected from the 14th passage of the virus that was not under the drug pressure. At the end of the molecular analysis, both gene regions were not detected for HSV-1 that was not under drug-resistant, while the presence of UL-23 and UL-30 gene regions of HSV-1 being under drug-resistance were detected.