Sığırlarda patojen leptospira türlerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile saptanması

Abstract

Amaç: Sığırlarda Leptospira hastalığına neden olan patojen Leptospira türlerinin sığırkan serumlarından lipL32 ve lfb1 genlerine dayalı kantitatif gerçek zamanlı PolimerazZincir Reaksiyonu (qRT-PZR) tekniğiyle saptanması amaçlandı.Materyal ve Metot: Bu çalışmada, Kars ili ve çevresinde abort yapmış 64 inek kanserum örneği ve Samsun ili Tekkeköy ilçesinde bulunan mezbahanede kesilen sağlıklısığırlardan alınan 25 adet kan örneği olmak üzere toplam 89 örnek kullanıldı. Serum vekan örneklerine ait genomik DNA'lar kalıp olarak kullanılarak, lipL32 ve lfb1 genleriqRT-PZR ve konvansiyonel PZR yöntemleri ile çoğaltıldı. Referans L. hardjo ve L.grippotyphosa serovarlarına ait DNA'lar pozitif kontrol, L. biflexa serovarına ait DNAnegatif kontrol olarak kullanıldı. PZR koşulları optimize edildi ve qRT-PZR ürünlerininsaptanma limiti belirlendi. DNA örneklerinin qRT-PZR'de elde edilen Ct değerlerinegöre sonuçlar değerlendirildi ve pozitif örnekler DNA elektroforezinde doğrulandı.Bulgular: Kan serum örneklerine ait DNA'larda lipL32 ve lfb1 genlerini hedefleyenqRT-PZR analizi sonucunda, MAT pozitif bulunan toplam 27 kan serumunun 14'ü(%51,85) lipL32 ve/veya lfb1 genlerine dayalı gerçek zamanlı PZR ile pozitif, 13'ü(%48,15) negatif olarak belirlendi. MAT negatif bulunan 37 serumdan 1'i (%2,7) lipL32geni pozitif, 1'i (%2,7) hem lipL32 hem de lfb1 genleri pozitif, 35'i (%94,6) negatifbulundu. Mezbahane kan örneklerinde pozitiflik belirlenmedi. qRT-PZR testininsensitivitesi %51,85, spesifitesi %94,6 olarak hesaplandı. Hedef DNA'ların saptanmalimitleri analizleri testin analitik sensitivitesinin yüksek olduğunu gösterdi. Patojen veapatojen Leptospira serovarları ve farklı bakteri türlerinin uygulanması sonucunda testinanalitik spesifitesinin yüksek olduğu saptandı.Sonuç: Abort yapmış sığır kan serumlarında patojen Leptospira türlerinin varlığı MATile karşılaştırmalı olarak spesifik lipL32 ve lfb1 genlerine dayalı qRT-PZR tekniğiylebelirlendi. Bu tekniğin Leptospirozis tanısında kullanılabilir olduğu benzer çalışmalardaolduğu gibi ortaya kondu.Anahtar Kelimeler: Leptospirozis; lipL32; lfb1; qRT-PZR

Aim: It was aimed to detect the pathogenic Leptospira species that cause Leptospirosisin cattle from cattle blood sera by quantitative real-time Polymerase Chain Reaction(qRT-PZR) technique based on lipL32 and lfb1 genes.Material and Method: In this study, a total of 89 samples constituted of 64 blood serafrom aborted cows from Kars province and the surrounding regions and 25 bloodsamples taken from healthy cows in a slaughterhouse located in the district of Tekkeköyin Samsun province were used. Genomic DNAs extracted from blood and blood serumsamples were used as the template and lipL32 and lfb1 genes were amplified by qRTPCRand conventional PCR methods. DNA's from reference L. hardjo and L.grippotyphosa serovars were used as positive control, L. biflexa DNA was used asnegative control. PCR conditions were optimized and detection limit of qPCR productswere defined. The results were evaluated according to Ct values of qRT-PCR and thepositive samples were confirmed by DNA electrophoresis.Results: As a result of the qRT-PCR analysis of DNA from the blood sera, 14 (51.85%)out of 27 MAT-positive blood sera were found positive based on lipL32 and / or lfb1genes, 13 (48.15%) of them were negative. From MAT negative sera, 1 sample (2.7%)was lipL32 gene positive, 1 (2.7%) was both lipL32 and lfb1 genes positive, 35(94.6%)of the samples were negative. Positivity was not determined from slaughterhouse bloodsamples. Sensitivity and specificity of qRT-PCR test were calculated as 51.85% and94.6% respectively. Analytical sensitivity of the test was found high based on limit ofdetection of target DNAs. Analytical specificity of the test was high by evaluation ofpathogen and apathogen Leptospira serovars and different bacteria species.Conclusion: In conclusion, the presence of pathogen Leptospira species in blood serumsamples from aborted cattle were determined by qRT-PCR targeting lipL32 andlfb1genes. The potential use of this technique for Leptospirosis diagnosis was presentedas shown in previous studies.Keywords: Leptospirosis; lipL32; lfb1; qRT-PCR