Brucella melitensis enfekte makrofajlarda cisplatin tedavisinin konak savunma sistemini güçlendirici etkilerinin araştırılması

Abstract

Bruselloz Brucella etkenleri tarafından hayvan ve insanlarda ekonomik ve önemlisaglık sorunları olusturan kronik karakterde enfeksiyöz bir hastalıktır. Hastalıkta konakcanlı savunma sisteminin zayıf uyarılması hastalıgın kroniklesmesinde önem tasır. Buçalısmada, kemoterapötik ajanlardan cisplatin tedavisinin Brucella melitensis ile enfektehücrelerde konak savunma sistemini güçlendirici etkileri arastırıldı. Arastırmada insanmonositik hücre hattı (U937) kullanıldı. Monositler makrofajlara dönüstürüldükten sonraB. melitensis ile enfekte edildi ve 48 saate kadar 20 ?M cisplatin ile muamele edildi.Cisplatinin konakta oksidatif stres, yangı gelisimi ve viabilite üzerine etkileri arastırıldı.Hücre kültürü süpernatantlarında malondialdehid (MDA) ve nitrik oksit (NO)seviyeleri, hücre homojenatlarında glutatyon (GSH) düzeyi, antioksidan enzimlerdenkatalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ile oksidanlardan ksantin oksidaz (XO)ve myeloperoksidaz (MPO) aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle belirlendi. Cisplatininenfekte hücrelerde canlı-ölü oranı üzerine etkisi tripan mavisi, viabilite ise kantitatif MTTtesti ile yapıldı. Yangı mediatörlerinden tümör nekroz faktör (TNF-) ve interlökin (IL?12)düzeyleri ticari ELISA kitleri kullanılarak yapıldı. Her iki sitokin ile uyarılabilir nitrikoksit sentaz (iNOS) mRNA transkripsiyon analizleri kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu(PCR) ile degerlendirildi.Nitrik oksit enfeksiyöz etkenlere karsı sitotoksisitede büyük önem tasıyan birmoleküldür. Ancak Brucella ile enfekte insan makrofajlarında NO üretiminin olmadıgısaptandı. Cisplatin tedavisi enfeksiyon süresince NO sentezini yüksek düzeylerde artırdı (p< 0.0001). Cisplatinin NO artırıcı etkisinin iNOS aktivasyonu ile gerçeklestigi tespit edildi.Tedavi ile artan NO Brucella enfekte makrofajlarda yaklasık %80 oranında viabilitekaybına neden oldu. Cisplatin GSH düzeyini düsürürken (p < 0.05), MPO ve XOaktivitelerini artırdı (p < 0.001). Antioksidan enzimlerden CAT degismezken, GSH-Pxaktivitesinde artıs gözlendi (p < 0.001). N-asetil sistein kullanımı cisplatinin neden olduguviabilite kaybını tamamen önledi. Bu sonuç, cisplatinin enfekte hücrelere yaptıgı sitotoksiketkide uyarılan oksidatif olayların önemini göstermektedir. Bununla birlikte cisplatinhücrelerde lipid peroksidasyonunu da artırdı. Brucella enfekte hücrelerde IL?12 ve TNF-üretimi saptanamazken, cisplatin bu iki mediyatör sentezini düsük düzeyde artırdı.Cisplatinin apoptotik etkisinde her iki sitokin sentezi de rol almıs olabilir.Bu arastırmadan elde edilen verilere göre, B. melitensis ile enfekte insanmakrofajlarında konak savunma sistemi yeterince uyarılmamaktadır. Cisplatin yangı veoksidatif stresi uyararak enfekte hücrelerde yüksek düzeylerde ölümlere yol açmaktadır.Bruselloz hastalıgının sagaltımında antibiyotik tedavinin yanı sıra apoptotik etkili digeralternatif yöntemlerin arastırılması önem tasıyabilir.Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Bruselloz, Brucella melitensis, Cisplatin, U937

Brucellosis is chronic infectious disease caused by Brucella spp. which leadseconomic and important health problems for human and animals. Weak stimulation of thehost?s immune system during the disease by Brucellae is an important factor for thechronic brucellosis. In this study, the intensifying effects of cisplatin, a chemotherapeuticagent, on the host?s defense system in Brucella melitensis infected macrophages wasinvestigated. For this purpose, human monocytic cell line (U937) was used. Monocyteswere first differentiated into macrophages and infected with B. melitensis then treated by20 ?M cisplatin up to 48 hours. The effect of cisplatin on viability, oxidative stress andprogression of inflammation was studied in the host.Malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels in cell culture supernatants,glutathione (GSH) levels in cell homogenates, the activities of antioxidant enzymes such ascatalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the activity of oxidants xanthineoxidase (XO) and myeloperoxidase (MPO) were analyzed by a spectrophotometer. Livedeadratio rate was determined by trypan blue dye exclusion and the effect of cisplatin onviability was verified by the quantitative MTT test. Inflammatory mediators such as tumornecrosis factor-alpha (TNF-) and interleukin-12 (IL?12) levels were determined bycommercial ELISA kits. Both of the cytokines and inducible nitric oxide synthase (iNOS)mRNA transcription analyses were evaluated by quantitative polymerase chain reaction(PCR).Nitric oxide has an important cytotoxic molecule against infectious agents.However no production of NO was established in Brucella infected macrophages. Cisplatintreatment was increased NO synthesis at very high levels (p < 0.0001) during infectionperiods. It was determined that cisplatin? enhancement of NO concentration managed byiNOS activation. Elevated NO caused viability lost approximately 80 % of Brucellainfected macrophages. Although cisplatin decreased GSH levels (p < 0.05), it significantlyincreased MPO and XO activities (p < 0.001). While CAT activity was not changed, anincrease of GSH-Px activity was observed (p < 0.001). N-acetyl cysteine treatment wascompletely prevented the viability lost caused by cisplatin. This result demonstrated thatoxidative events which were induced by cisplatin treatment are important for the combatbrucellosis. However, cisplatin has also increased lipid peroxidation in the cells. There wasno IL?12 and TNF- production in Brucella infected cells, though cisplatin increased bothof the mediators at low levels. These cytokines may play role on the cytotoxic effect ofcisplatin.It was concluded that host? defense mechanisms was not induced enough in B.melitensis infected cells. Cisplatin caused excessive amounts of death in Brucella infectedcells with cytotoxic action by inducing inflammation and oxidative stress. Besidesantibiotic treatments in human brucellosis, other apoptotic agents should be considered andmore investigated as an alternative method.Keywords: Apoptosis, Brucellosis, Brucella melitensis, Cisplatin, U937.