Lipaz enziminin immobilizasyonu ve aromatik esterlerin sentezinde kullanımı

Abstract

Bu çalışmada başlıca kalsiyum-alginat/kitosan (Ca-Alg/Kitosan) jele hapsetme yöntemiyle ve kitosan desteğe kovalent bağla immobilize edilmiş Candida rugosa (CRL) ve domuz pankreası (PPL) kaynaklı lipaz enzimleri kullanılarak aromatik ester üretimi amaçlanmıştır. Başlangıçta lipaz katalizi ile 15 farklı aroma esteri sentezlenmiş ve kokularına göre izoamil asetat ve hekzil asetat olmak üzere 2 tanesi araştırma amacıyla seçilmiştir. Aroma ester sentezi 4 enzim örneği (2 farklı lipaz ve 2 farklı destek) ve 2 farklı aroma esteri için ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Reaksiyon ortamını belirlemek için ester sentezi hekzan, heptan, toluen, ksilen, kloroform ve ayrıca çözücüsüz ortamda gerçekleştirilmiştir. Tüm enzim türü ve aromalar için en iyi sonuçlar heptan ortamı için elde edilirken çözücüsüz ortamda en düşük üretim elde edilmiştir. İmmobilizasyon koşulları Ca-Alg/kitosan destek için sodyum alginat derişimi, kitosan derişimi, glutaraldehit derişimi ve kuruluk oranı, kitosan destek için ise arakol türü ve glutaraldehit derişimi açısından optimize edilmiştir. Ester sentezi için reaksiyon sıcaklıkları 30-60 ? C arasında değiştirilmiş ve en iyi sonuçlar Ca-Alg/Kitosan ve kitosan destek için sırasıyla 45 ve 40 ? C olarak elde edilmiştir. Asit ve alkol substratlarının derişimleri 10, 25, 50, 75 ve 100 mM arasında kullanılarak substrat çiftlerinin en uygun derişim değerleri elde edilmeye çalışılmıştır. En yüksek ester üretimi genellikle 50 mM asit ve alkol derişimlerinde elde edilmiş ve daha yüksek substrat derişimlerinde ester veriminin düştüğü gözlenmiştir. Ester üretimi ayrıca kesikli ve dolgu yataklı sürekli kolon reaktörlerde 8 saat reaksiyon süresince gerçekleştirilmiştir. İmmobilize lipazların 40 ? C'deki termal kararlılıkları 24 saat süreyle belirlenmiştir. Ayrıca depolama kararlılıkları 4 ? C'de 60 gün boyunca izlenmiştir. 60 günün sonunda Ca-Alg/kitosana immobilize edilmiş CRL ve PPL lipazlarının başlangıca göre sırasıyla % 36,8 ve % 33 aktivite gösterdikleri gözlenmiştir. Kitosan destek kullanıldığında ise bu değerler Candida rugosa ve domuz pankreası lipazları için sırasıyla %24,4 ve % 21,3 olarak belirlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Candida rugosa lipazı, Domuz pankreası lipazı, İmmobilizasyon,Sodyum alginat, Kitosan, Aroma esteri, izoamil asetat, hekzil asetat.

This study was mainly aimed the aroma ester production by immobilized Candida rugosa (CRL) and porcine pancreatic (PPL) origin lipases entrapped into calcium alginate/chitosan (Ca-Alg/Chitosan) gel and covalently bound onto chitosan support. Firstly fifteen different aroma esters were synthesized by lipase catalysis and two of them, iso-amyl acetate and hexyl acetate, were selected to investigate according to their fragrance. Aroma ester synthesis for 4 enzyme samples (2 different lipases with 2 different supports) and for 2 different flavors were investigated in detail. Ester synthesis were carried out in hexane, heptane, toluen, xylen, chloroform and also in solvent free medium. The best results were obtained in heptane for all enzyme types and aroma esters while in solvent free medium production was the lowest. Immobilization conditions such as sodium alginate, chitosan and glutaraldehyde concentrations and drying level for Ca-Alg/Chitosan support, and spacer arm type and glutaraldehyde concentration for chitosan support were optimized. Reaction temperatures for ester synthesis were changed between 30 and 60 ? C and the best results were obtained at 45 ? C and 40 ? C for Ca-Alg/Chitosan and chitosan supports, respectively. Acid and alcohol concentrations used as 10, 25, 50, 75 and 100 mM to determine optimal substrate concentration couples. It was found that maximum ester production were achieved generally at 50 mM acid and alcohol substrates, and ester yields decreased at higher substrate concentrations. It was also carried out the production of esters in batch and continuous fixed bed column reactors for 8 hours of reaction time. Thermal activities of immobilized lipases were investigated during 24 hour at 40 ? C. Storage stabilities at 4 ? C was also determined for 60 days. It was observed that, Candida rugosa and porcine pancreatic lipase immobilized into Ca-Alg/Chitosan beads showed 36.8 % and 33% of their initial activity, respectively at the end of the 60 days. These values were determined as 24.4 % and 21.3 % for Candida rugosa and porcine pancreatic lipase immobilized onto chitosan, respectively.Key Words: Candida rugosa lipase, Porcine pancreatic lipase, Immobilization, Sodium alginate, Chitosan, Aroma esters, Iso-amyl acetate, Hexyl acetate