Yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemi ile hidroksiprolin tayini ve sigaranın idrardaki hidroksiprolin derişimine etkisi

Abstract

İdrarda hidroksiprolin tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazında iki farklı dedektörle iki farklı yöntem oluşturulmuş ve çalıştırılmıştır. Yöntemlerin en önemli basamağı türevleme olduğu için en uygun türevleme süresi, sıcaklığı ve pH değeri araştırılmıştır.Ultraviyole dedektörle yapılan ölçümlerde türevleme için en uygun türevleme süresi 20 dakika, türevleme sıcaklığı 90 °C ve türevleme pH'sı 9,5 olarak bulunmuştur. Elektrokimyasal dedektörle yapılan ölçümlerde ise en uygun türevleme süresi 10 dakika, türevleme sıcaklığı 80 °C ve türevleme pH'sı 12,5 olarak bulunmuştur. Bu şartlar altında yapılan analizlerde ultraviyole dedektör için kurulan yöntemde hidroksiprolinin alıkonma süresi 4,6 dakika, elektrokimyasal dedektörde 3,2 dakika olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, yöntemlerin ve cihazın gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik çalışmaları da yapılmıştır. İdrar numunelerinde geri kazanım verimi ultraviyole dedektör için 108±6; elektrokimyasal dedektör için de 102±7 bulunmuştur.Geliştirilen yöntemler sigara içen ve içmeyen bireylerden toplanan idrar örneklerindeki hidroksiprolin düzeylerini belirlemek için kullanılmıştır. Bu sayede sigara içiminin hidroksiprolin düzeyine etkisi incelenmiştir. Sigara içen bireylerle sigara kullanmayan bireylerin hidroksiprolin/kreatinin oranı karşılaştırılmış ve her iki dedektörle yapılan analizlerde istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık olduğu tesbit edilmiştir.Anahtar Kelimeler: Hidroksiprolin, HPLC, idrar, ultraviyole dedektör, elektrokimyasal dedektör, sigara

Two different methods with two different detectors were set up and operated in the HPLC for the determination of hydroxyproline in urine samples. As the most important step of the methods was derivatization, the most appropriate time, temperature and pH of the derivatization were investigated.The most appropriate derivatization time, temperature and pH were found as 20 min., 90 ºC and 9.5 using ultraviolet detector, respectively. The most appropriate derivatization time, temperature and pH were found as 10 min., 80 ºC and 12.5 using electrochemical detector, respectively. At analyses done under these conditions, the retention time of hydroxyproline for the method which was set for the ultraviolet detector was identified as 4,6 min and 3,2 min for electrochemical detector. In addition, intra-day and inter-day reproducibility running of the methods and instrument were carried out. While the recovery yield in urine samples for ultraviolet detector was 108±6, it was found 102±7 for the electrochemical detector.Developed procedures were used for the determination of hydroxyproline levels in the urine samples obtained from smokers and non-smokers. Therefore, the effect of smoking on hydroxyproline level was examined. Hydroxyproline/creatinine ratio of smokers and non-smokers was compared, and it was determined that there was a statistically significant difference in the analyses done with both detectors.Keywords: Hydroxyproline, HPLC, urine, ultraviolet dedector, electrochemical dedector, cigarette