Kitin deasetilaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, kitin polisakkaritinin kitosana biyodönüşümünü katalizleyen ekstraselüler kitin deasetilaz enziminin, Bacillus cereus suşundan kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu analiz edilmiştir. Kolloidal kitin içeren katı besiyerinde 30ºC'de bir hafta inkübasyonu takiben kolonisinin etrafında sarı zon gözlenerek seçilen bu izolat, VITEK identifikasyon sistemi ile tanımlanmıştır. Sıvı fermantasyon ortamında geliştirilen hücre kültürlerinin santrifujlenmesi ile elde edilen ham enzim preparatının spesifik aktivitesi 0,274 U/mg olarak belirlenmiştir. Kitin deasetilaz enziminin optimum aktivitesini 50°C ve pH 7.0'da gösterdiği ortaya konmuştur. Enzimin 50°C sıcaklıkta 20 dakika ön inkübasyonu sonrası aktivitenin %115'e kadar arttığı saptanmıştır. 5 mM konsantrasyonda asetik asit (%105), gliserol (%123), CoCl2 (%113), NaCl (%137) ve CaCl2 (%102)'ün enzim aktivitesini stimule ettiği, fakat EDTA (%81.12) ve TritonX-100 (%75.5)'ün ise inhibitör ajan olarak davrandığı gözlenmiştir. SDS, 2-merkaptaetanol, MgCl2 ve MnCl2 varlığında ise aktivitenin sırasıyla %97, %89, %64 ve %83 korunduğu belirlenmiştir. SDS-PAGE analizlerinde, kısmi saflaştırılmış ekstraselüler kitin deasetilaz enzimine ait 39 kDa moleküler ağırlığında tek protein bandı elde edilmiştir.Anahtar kelimeler: Bacillus cereus, kitin deasetilaz, kısmi saflaştırma, karakterizasyon

In this study, the partial purification from Bacillus cereus strain and characterization of the extracellular chitin deacetylase enzyme, catalyzes the bioconversion of chitin polysaccharide to chitosan, were analyzed. Following the incubation period on solid media containing colloidal chitin at 30ºC for one week, this selected isolate by observing the yellow zone around the colony was identified by VITEK identification system. The specific activity of the obtained crude enzyme preparation by centrifugation of cell cultures were developed in the liquid fermentation medium was determined as 0,274 U/mg. The optimum activity of chitin deacetylase enzyme was emerged at 50°C and pH 7.0. After the pre-incubation of enzyme at 50°C for 20 min, its activity was detected to increase up to 115%. It was observed that acetic acid (%105), glycerol (%123), CoCl2 (%113), NaCl (%137) and CaCl2 (%102) in 5 mM concentrations stimulated its activity but EDTA (%81.12) and TritonX-100 (%75.5) behaved as the inhibitory agent. In the presence of SDS, 2-mercaptoethanol, MgCl2 and MnCl2, the activity was determined to protect %97, %89, %64 and %83, respectively. In SDS-PAGE analysis, single protein band in 39 kDa molecular weight belonging to the partially purified extracellular chitin deacetylase enzyme was obtained. Keywords: Bacillus cereus, chitin deacetylase, partial purification, characterization