Evolutionary engineering of freeze tolerance in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Maya hücreleri doğada serbest halde yaşayan tek hücreli organizmalardır. Doğal çevrelerinde ve endüstriyel prosesler süresince büyük ölçüde değişen ortam koşulları ile karşılaşırlar. Çevre şartlarındaki fiziksel veya kimyasal değişimler ideal yaşam koşullarından sapmaya neden olur. Bu da metabolizmalarının değişmesine neden olabilir.Donma prosesi bir çok doğal habitatta, geceleri sıcaklığın 00C altına düştüğü yerlerde ve sıcaklığın sürekli olarak düşük olduğu yerlerde görülür. Donma hasarı mekanizması henüz tam olarak açıklanamamıştır. S. cerevisiae,biyokimyası ve genetiği iyi bilinen bir model organizma olarak, donma-erime hasar mekanizmasını çalışmak için uygun bir mikroorganizmadır.Bu çalışmada amaç, bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik yöntemi ile donmaya toleranslı Saccharomyces cerevisiae hücreleri elde etmektir. Evrimsel mühendislik yöntemi başarı ile uygulanmış ve donmaya toleranslı ve buna paralel olarak farklı stres koşullarına karşı da çapraz direnç geliştirmiş bireyler elde edilmiştir. Hücrelerin stres koşullarına maruz kaldıktan sonraki hayatta kalma oranları en muhtemel sayı (most probable number, MPN) yöntemi ile, spesifik katalaz aktivitesi ise enzimatik analizlerle belirlenmiştir. Elde edilen mutant hücrelerin çoğunun birden fazla strese karşı direnç kazandıkları görülmüştür. Ayrıca stressiz koşullarda yapılan deneylerde dahi mutant hücrelerin spesifik katalaz aktivitelerinin yabanıl tipe oranla çok daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Transkriptomik ve proteomik analizler ve yapılacak araştırmalar, canlılarda strese karşı direnç mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasında ve hücrelerin dondurularak saklanması ve donmuş hamur teknolojisi gibi uygulamalarda kullanımında faydalı olacaktır.

Yeast cells are single cell organisms that are living freely in nature. They face large variations in their natural environment and during industrial processes. Declination from the optimal conditions can be a result of physical or chemical changes in the environment. These can alter their metabolism.The freezing process occurs in most natural habitats where the temperature decreases below 00C at night, and also in some regions where the temperature is permanently cold. The mechanism of freeze injury is not well understood yet. As a biochemically and genetically well characterized model organism, S. cerevisiae is suitable to study the freeze-thaw injury mechanism.In this study, the aim was to obtain freeze tolerant S. cerevisiae cells by using an inverse metabolic engineering strategy; evolutionary engineering. By designing and using evolutionary engineering strategies, freeze-tolerant individual cells were successfully obtained with concomitant cross-resistances towards other stress conditions. Survival values of cells after exposure to stress conditions were determined by most probable number (MPN) method and specific catalase activity by enzymatic analysis. Most of the mutant cells were found to be multi-stress resistant. Moreover, experimental results showed that the specific catalase activity of the mutant cells were significantly higher than those of the wild type even in the absence of any stress conditions. The transcriptomic and proteomic analysis and further investigations may help to better understand the mechanism of stress tolerance and ultimately exploit it for cryopreservation applications and frozen dough technology