Effect of elk1 and YY1 transcription factors on SPG4 and KATHB1 promoters

Abstract

Hücre iskeleti, mitoz, sitokinez, hücreye şeklinin verilmesi, hücrenin hareketi gibi mühim faaliyetlerde görev alan önemli bir ağ yapısıdır. Hücre iskeleti üç temel polimerik yapıdan meydana gelir. Bunlar ara filamentler, mikrofilamentler ve mikrotübüller olarak adlandırılırlar. Sinir hücrelerindeki nörofilamentler ve epitel hücrelerindeki keratin ara filamentlere örnek verilebilir. Bu yapılar hücreye mekanik dayanıklılık kazandırırlar.Hücre iskeletinin diğer bir üyesi olan aktin filamentler yani mikrofilamentler, bir çok hücresel işlevde görev alırlar. Başlıca fonksiyonları, hücre şeklinin korunması, sitoplazma yoğunluğunun sağlanması, organellere tutunma yüzeyi hazırlanması ve kasların kasılmasını kontrol etmesi olarak sıralanabilir.Hücre iskeletini oluşturan diğer bir yapı ise mikrotübüllerdir. Mikrotübüller temel olarak hücre morfolojisini, hücre bölünmesini ve hücre içi organel taşımasını sağlarlar. Mikrotübüller oldukça dinamik bir yapıya sahiptirler. Bu dinamizmi sağlayan iki mekanizma vardır. Birincisi intirinsik yol olan ?dinamik instabilite? yani mikrotubullerin hızlı bir şekilde polimerizasyonu ve depolimerizasyonudur. İntirinsik mekanizma ?-tubulin ve ß-tubulin heterodimerlerinin büyüyen ve kısalan mikrotübül zincirine eklenip ya da ayrılımasıyla meydana gelir. ?-ß heterodimerleri bir ara geldiğinde GTP hirolizi gerçekleşir ve böylelikle mikrotübüllerin gövdesi GDP bağlı tübülin dimerlerini barındırır. Mikrotübüllerin uç kısmında ise GTP bağlı ß-tubulinler bulunur. GDP bağlı tubulinler daha stabil bir yapı oluşturlar. GTP bağlı tubulinlerin bulunduğu, hızlı bir şekilde polimerize ve depolimerize olan uç artı (+) diğer uç ise eksi (-) olarak adlandırılır. Eğer GTP ucundaki ß-tubulin üzerinde bulunan GTP başka bir GTP-bağlı ß-tubulin eklenmeden GDP'ye dönüştürülürse mikrotübüler hızlı bir şekilde depolimerize olurlar. Yalnız GTP-tubulinler sadece artı uçta değil microtubul gövdesinde de bulunabilirler. Böylelikle depolimerize olan microtübüllerin bu noktalara gelindiğindee tekrar polimerize olması sağanır.Mikrotübüller sinir hücrelerinin akson ve dendritlerinde yoğun demetler halinde bulunarak bu yapıların uzamasını ve korunmasını sağlarlar. Sinir hücrelerinde bulunan mikrotübüller sentrozomlardan çekirdeklenirler ve mikrotübül kesen enzmiler aracılığıyla buralardan ayrılarak kısa parçalar halinde sinir hücresinin uzantılarına taşınırlar. Bu taşınma mikrotübül ne kadar kısa olursa o kadar hızlı gerçekleşir. Diğer bir deyişle taşınma hızı mikrotübül boyu ile ters orantılıdır. Mikrotübüllerin küçük parçalara kesilmesi için AAA ailesi ATPaz'larından olan katanin ve spastin'e ihtiyaç duyulur. Mikrotübül kesen bu iki enzim nöron gelişiminde önemli bir role sahiptirler. Benzer çalışma mekanizmasına sahip olmakla beraber bu proteinler microtübüllerin farklı boyutlarda kesilmesini sağlarlar Spastinden farklı olarak, katanin iki farklı altbirimden oluşur. Bunlar enzimatik faaliyet gösteren ve AAA ATPaz bölgesi içeren p60 ve enzimatik görevi olmayan p80'dir. p80'in görevi ise p60'a bağlandığında p60'ın kesim aktivitesini artırmak veWD40 bölgesi ile p60'ı sentrozomlara konuşlandırmaktır.Yapılan araştırmalar sonucu kataninin sinir sisteminde oldukça yoğun olarak ifade edildiği saptanmış ve baskılandığı zaman microtübül uzunluğunda artış gözlemlenmiştir. Bu artışın ise akson gelişimini olumsuz etkilediği ve ayrıca microtubullerin sentrozomlarda birikmesine de sebep olduğu gösterilmiştir. Bu da kataninin mikrotübüllerin sentrozomlardan ayrılması ve akson büyümesi için ne kadar gerekli olduğunu göstermektedir. Fareler üzerinde yapılan bir deneyde ise Alzheimer hastalığı modeli olarak kullanılan transgenik farelerin hipokampüslerinde katanin seviyesinin kontrol farelere göre daha az olduğu gösterilmiştir. Buradan da kataninin nöronların dejenere olup olmamasında belirgin bir rol oynadığı anlaşılmaktadır.Diğer bir mikrotübül kesen enzim, spastin, otozomal dominant Herediter Spastik Prapleji (HSP) hastalığına sebep olan spastin kodlayan SPG4 genindeki mutasyonların incelenmesi aşamasında bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda spastin proteininin aşırı üretildiği hücrelerde dağılmış bir mikrotübül ağına rastlanmaktadır. Spastin seviyesinin düşürüldüğü diğer çalışmalarda ise, bu azalışın morfolojik olgunluğa erişimi engellediği, sinaptik boşluğu küçülttüğü ve sinaptik mikrotübülleri arttırdığı belirtilmiştir.Bütün diğer proteinlerde olduğu gibi hücre içindeki katanin ve spastin miktarı da transkripsiyon mekanizması ile düzenlenir. Bu düzenlemenin kontrolü ise gen anlatımını sağlayan promotor bölgelerine bağlanan transkripsiyon faktörleri aracığıyla gerçekleşir. Elk1 ve YY1 bunlardan yalnızca iki tanesidir.Ets ailesi transkripsiyon faktörlerinden olan Elk1 ve GLI-Kruppel zinc finger proteini YY1 hedef genin hem aktivasyonunu hem de represyonunu sağlayabilirler. Bu iki transkripsiyon faktörüne beyin de dahil olmak üzere çeşitli dokularda sıkça rastlanılmaktadır. İki transkripsiyon faktörünün de fonksiyonunu düzenleyen farklı bölgeleri vardır. Elk1 N-terminal DNA bağlanma bölgesine sahipken, YY1 DNA ile C-terminalde bulunan 4 zinc finger vasıtasıyla bağlanır. Her iki protein de tranlasyon sonrası çeşitli modifikasyonlara uğramaktadırlar. Bu modifikasyonlardan, kinaz yolağı aracılığıyla sağlanan serin (Ser, S) ve treonin (Thr, T) amino asitlerinin fosforilasyonu, transkripsiyon faktörlerinin ilgili gen ifadesinde aktivatör rol üstlenmesine sebep olurken; bir diğer modifikasyon olan SUMOlanma ise gen ifadesinin baskılanmasına yol açmaktadır.Bütün bu bilgiler bir arada düşünüldüğünde, sırasıyla spastin ve katanin proteinlerinin ifadesini sağlayan SPG4 ve KATNB1 promotorlarının YY1 ve Elk1 ile nasıl regüle edildiğinin tespit edilmesi son derece önem teşkil etmektedir. Böylelikle nöronal gelişimde ve nörodejenerasyonda önemli role sahip mikrotübül kesen enzimlerin, YY1 ve Elk1 transkripsiyon faktörlerinin etkisinde miktarlarında ne gibi bir değişikliğe sahip olduğu ve bu etkiyi yaparken ilgili transkripsiyon faktörlerinin hangi yolaklardan etkilendiği saptanabilir.Bu çalışmada, öncelikle SPG4 ve KATNB1 gen promotorlarının YY1 ve Elk1 transkripsiyon faktörlerinin etkisi altında olup olmadığını belirlemedeki ilk adım olan, ilgili gen bölgelerine transkripsiyon faktörlerinin bağlanıp bağlanmadığını belirlemek amaçlanmıştır. Bu etkileşimi saptamak için laboratuarımız tarafından belirlenmiş KATNB1 ve SPG4 optimal promotorlarında bu iki transkripsiyon faktörünün olası bağlanma bölgeleri biyoinformatik araçlar kulanılarak belirlenmiştir. Daha sonra EMSA yöntemi ile Elk1 ve YY1'in bu bölgelere bağlandığı doğrulanmıştır. Bu aşama sonrasında bağlanmanın YY1 ve Elk1'e özgünlüğünün tespiti için rekombinant proteinler üretilmiştir. Elde edilen rekombinant proteinler Elk1 ya da YY1'ın yalnızca DNA bağlanma bölgesini içermektedir. Elde edilen sonuçlara göre ilgili bölgelere bağlanan proteinlerin YY1ve Elk1 olduğu doğrulanmıştır.YY1 transkripsiyon faktörünün SPG4 ve KATNB1 promotorlarına bağlandığı belirlenmesinin ardından YY1'ın katanin ve spastinin gen anlatımındaki rolünün tayin edilmesi gerekmektedir. Bilindiği gibi YY1 hem aktivatör hem de represör olarak görev alabilmektedir. Bundan dolayı YY1'ın aktivatör ya da represör olarak görev almasını sağlayan bölgeler çıkarılarak YY1 fonksiyonunda etkili yolakların da belirli bir oranda etkisi incelenmiştir. Ayrıca transkripsiyon faktörlerinin represör etki göstermesinde önemli olan SUMO modifikasyonu da YY1'in SUMOlanma bölgesi mutasyona uğratılarak incelenmiştir. Sonuçlar göstermiştir ki YY1 transkripsiyon faktörü hem KATNB1 hem de SPG4 promotorları üzerinde baskılayıcı rol oynamaktadır ve bu baskılanma SUMO modifikasyonundan ziyade YY1'in glisin/lizin zengin bölgesi ile sağlanmaktadır.

Cytoskeleton is an important network for cellular processes such as mitosis, cytokinesis, cell shape and motility. The cytoskeleton consists of three types of polymeric fibers: intermediate filaments, microfilaments, and microtubules. Intermediate filaments provide cells mechanical strength, such as keratins in epithelial cells and neurofilaments in neurons. Another component of cytoskeleton, actin microfilament, is involved in various cellular functions such as contraction of muscles, maintenance of cell shape. The last member of the cytoskeleton is microtubules. Microtubules are very dynamic structures and they have active roles in cell division, cell morphogenesis and intracellular organelle transport. The dynamic structure of microtubules is provided by two mechanisms. One of the mechanisms is dynamic instability, rapid polymerization and depolymerization; the other mechanism is cleavage of microtubules by microtubule-severing enzymes.Microtubule-severing enzymes katanin and spastin are members of AAA super family of ATPases. They severe microtubules into shorter polymers which are essential for neurogenesis. Although both of these proteins are microtubule severing enzymes and their mechanism of action is similar, they cut microtubules in different legths. Katanin is composed of two subunits: p60 subunit contains AAA ATPase domain, which severs microtubules and non-ezymatic p80 subunit which enhances severing activity of p60. Katanin is highly expressed in nervous system and its inhibition or overexpression impairs axon formation. Furthermore, mouse model of Alzheimer?s disease showed that katanin levels in hippocampus of transgenic mice was less compared to wild-type mice.The other microtubule-severing enzyme, spastin is encoded by SPG4 gene and mutation in SPG4, causes Hereditary Spastic Paraplegia disease. Studies showed that wild-type spastin overexpressing cells have disrupted microtubule network. It has been shown that downregulation of spastin caused morphologic undergrowth, reduced synaptic area, and increased synaptic microtubules by in vivo experiments. Conversely, overexpression of spastin reduced the synaptic strength and amount of synaptic microtubules.Transcription factors YY1, a GLI-Kruppel class of zinc finger protein, and Elk1 Ets family of transcription factor are able to contribute both in activation and repression of the target gene and are ubiquitously expressed in different tissues as well as in brain.Our aim in this study was to identify the regulation of SPG4 and KATNB1 gene expression by Elk1 and YY1 transcription factors. The optimal promoters of KATNB1 and SPG4 have been previously identified by our laboratory. For this purpose, we started with analyzing the binding of these proteins to the corresponding promoter regions. For this purpose, we performed EMSA by using oligonucleotides including related transcription factor binding sites, which are predicted on SPG4 and KATNB1 promoter and confirmed the binding of Elk1 and YY1. To further confirm the specificity of the binding, we produced recombinant Elk1 and YY1 proteins that contain only DNA binding domain and performed supershift assay by using these recombinant proteins.To investigate regulation of SPG4 and KATNB1genes by YY1, different YY1 constructs, which lack of activation or repression domain were obtained. The results demonstrated that YY1 act as a repressor on both KATNB1 and SPG4 promoters. It is known that SUMOylation can make a transcription factor to act as a repressor. So that we mutated YY1?s SUMO binding site in order to obtain SUMO defficient YY1 transcription factor and to explore the function of SUMO modification on YY1. Luciferase reporter assay results showed that vast majority of repressor function of YY1 is due to its glycine/lysine rich domain rather than SUMOylation.