Kars yöresinde yetiştirilen kazlardan termofilik campylobacter türlerinin izolasyonu, moleküler yöntemlerle identifikasyonu ve antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi

Abstract

Termofilik Kampilobakter türleri yabani ve evcil kanatlıların sindirim sisteminde bulunan ve zoonotik karakterleri ile insanlarda infeksiyon oluşturan bakterilerdir. Kanatlılarda yaygın asemptomatik kolonizasyonunun yanı sıra diyare, hepatit ve yumurta veriminde azalma gibi nispeten ılımlı infeksiyonlara yol açan Campylobacter jejuni, Campylobacter coli ve Campylobacter lari gibi termofilik türler, insanlarda gözlenen en yaygın gastroenteritis etkenleri arasındadır. Enfekte hayvanlarla direkt temas veya bu hayvanların dışkılarıyla bulaşık su ve az pişmiş gıdaların (özellikle kanatlı karkası) tüketilmesi sonucu bulaşan termofilik Kampilobakter infeksiyonlarının epidemiyolojisinde kanatlıların kloakal etken taşıyıcılığı önemli rol oynar. Bu çalışmada, Kars yöresinde yaygın yetiştiricilik alanı olan kazlarda termofilik Kampilobakter türlerinin kloakal varlığının ve yaygınlığının araştırılması amaçlandı. Bu kapsamda kolakal svap örneklerinden termofilik Kampilobakter türlerin kültürel yöntemlerle izolasyonu, moleküler ve kütle spektrofotometresi ile identifikasyonu ve izolatların antimikrobiyal madde duyarlılıklarının kültürel ve moleküler yöntemlerle analizi hedeflendi. Çalışma materyalini, Kars il merkez ve ilçelere ait köylerde aile tipi kaz yetiştiriciliğinin yapıldığı farklı işletmeden alınan klinik olarak sağlıklı 400 kaza ait kloakal sıvap örneği oluşturdu. Kloakal sıvap örneklerinden termofilik Kampilobakter türlerinin izolasyonu %7 defibrine at kanı, Campylobacter Growth Supplement ve Preston Campylobacter Selective Supplement içeren 10 ml Brucella Brot besiyerinde 42 ̊C'de mikroaerobik ortamda 48-72 saat ön zenginleştirmeyi takiben, örneklerin selektif besiyerine (Modified Charcoal Cephoperozone Deoxycholate Agar (mCCDA)) ekilmesi ve mikroaerobik şartlarda 42 ̊C'de 48-72 saat inkübasyonu sonrası gerçekleştirildi. Üreme karakteristikleri, makroskobik ve mikroskobik morfolojilerine göre Campylobacter spp. ön tanısı konulan etkenlerin identifikasyonu multipleks PZR (m-PZR) ve MALDI-TOF MS (VITEK-MS, BioMerieux) ile yapıldı. Termofilik Kampilobakter izolatlarının antimikrobiyal madde duyarlılıkları disk difüzyon tekniği ile belirlendi. Bu kapsamda, Azitromisin (15 µg), Tetrasiklin (30 µg), Siprofloksasin (5 µg), Gentamisin (10 µg) ve Ampisilin (10 µg) antibiyotik duyarlılıkları test edildi. İlgili antibiyotiklere karşı olası dirençten sorumlu olan yaygın direnç genlerinin analizi PZR ile gerçekleştirildi. Bu amaçla, Azitromisin direnci için ermB, Gentamisin için aphA-3, Tetrasiklin için tetO, Siprofloksasin için gyrA ve Ampisilin için blaOXA61 direnç genleri araştırıldı. Veriler, SPSS Statistic 20.0 programı ile analiz edildi ve yorumlandı. Çalışmada, Ocak-Ekim 2020 ayları arasında Kars il merkez ve ilçelere bağlı farklı işletmeden alınan 400 kaz kloakal sıvap örneğinin kültürel analiz sonrası 157 (%39,3)'sinden etken izolasyonu gerçekleştirildi ve Campylobacter spp. ön tanısı konuldu. Campylobacter spp. olarak tanımlanan izolatların mPZR analizleri sonrası 151 (%96,2)'i C. jejuni ve 6 (%3,8)'sı C. coli olarak tanımlandı. Tanımlanan izolatların 125'inin MALDI-TOF MS ile analizleri gerçekleştirildi. Böylelikle mPZR ile %100 uyumlu şekilde izolatların 119 (%95,2)'u C. jejuni ve 6 (%4,8)'sı C. coli olarak doğrulandı. Antimikrobiyal madde duyarlılık testleri sonucu 157 izolatın 53 (%33,8)'ü Ampisiline, 65 (%41,4)'i Tetrasikline, 118 (%75,2)'i Siprofloksasine, 19 (%12,1)'u Gentamisin ve 12 (%7,6)'si Azitromisine dirençli saptandı. Dirençli izolatlar arasında PZR ile saptanan ilgili direnç gen pozitifliği; blaOXA61 için 19 (%35,2), tetO için 59 (%90,8), gyrA için 60 (%50,8) ve aphA-3 için 10 (%52,7) belirlendi. Azitromisine dirençli izolatlar arasında ermB direnç genine rastlanılmadı. Kaz yetiştiriciliğinde lokal ve geleneksel olarak önemli bir paya sahip olan Kars yöresinde kazlarda termofilik Kampilobakterlerin kloakal kolonizasyonu yüksek saptanmıştır. Temel bulaşmanın dışkı ile bulaşık ve yeterince ısıl işlem görmemiş kanatlı karkaslarının tüketimi aracılı olduğu Kampilobakter infeksiyonlarında kazların kloakal etken taşıyıcılığı ve dışkı ile nihai saçılımları halk sağlığı açısından risk oluşturabilmektedir. İşletme düzeyinde gerçekleştirilecek biyogüvenlik uygulamaları, gıda üretim zincirinde alınacak hijyenik önlemler ve etkenlerin periyodik izlenmesi, insanlarda enfeksiyonların insidansını azaltacak hamleler olarak öngörülmektedir. Ayrıca izolatlar arasında yaygın antibiyotik direncinin belirlenmesi, tedavi için doğru antibiyotik tercihini ve gelişigüzel antibiyotik kullanımının sınırlanmasını önemli kılmaktadır. Anahtar kelimeler: Campylobacter spp., kaz, mPZR, MALDI-TOF MS, antibiyotik direnci

Thermophilic Campylobacter species are bacteria that found in the digestive system of wild and domestic poultry and cause infection in humans by their zoootic characters. Thermophilic Campylobacter species such as Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Campylobacter lari, which cause widespread asymptomatic colonization in poultry, besides of relatively mild infections such as diarrhea, hepatitis and decreasing in egg production, are among the most common causes of gastroenteritis observed in humans. Cloacal agent carrier features of poultry play an important role in the epidemiology of thermophilic Campylobacter infections, which are transmitted by direct contact with infected animals or by consuming water and undercooked foods (especially poultry carcass) contaminated with the feces of these animals. In this study, it was aimed to investigate the cloacal presence and prevalence of thermophilic Campylobacter species in geese, which are widely raised in Kars region of Turkey. In this context, isolation of thermophilic campylobacteria from colacal swab samples by cultural methods, identification by molecular and mass spectrophotometry, and analysis of antimicrobial agent sensitivity of isolates by conventional and molecular methods were worked up.The study material was composed of cloacal swab samples of 400 clinically healthy geese taken from different farms where family-type goose breeding carried out in the villages belong to Kars city center and districts. Isolation of thermophilic Campylobacter species from cloacal swab samples was initiated with a pre-enrichment step performed with the cultivation of the samples in 10 ml Brucella Broth supplemented with 7% defibrinated horse blood, Campylobacter Growth Supplement and Preston Campylobacter Selective Supplement at 42 ̊C for 48-72 hours incubation under microaerobic conditions. Subsequently, the samples were cultivated on selective medium (Modified Charcoal Cephoperozone Deoxycholate Agar (mCCDA)) and incubated for 48-72 hours at 42 ̊C under microaerobic conditions. Identification of the agents, which were preliminarily diagnosed as Campylobacter spp. according to their growth characteristics, macroscopic and microscopic morphological findings, was performed by multiplex PCR (m-PCR) and MALDI-TOF MS (VITEK-MS, BioMerieux). Antimicrobial susceptibilities of thermophilic Campylobacter isolates were determined by disk diffusion technique. In this context, Azithromycin (15 µg), Gentamicin (10 µg), Tetracycline (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg) and Ampicillin (10 µg) antibiotic susceptibilities were tested. Analysis of common resistance genes responsible for possible resistance to the relevant antibiotics was performed by PCR. For this purpose, ermB for Azithromycin resistance, aphA-3 for Gentamicin, tetO for Tetracycline, gyrA for Ciprofloxacin and blaOXA61 for ampicillin were investigated. The data were analyzed and interpreted with the SPSS Statistic 20.0 program.In the study, agent isolation was achieved from 157 (39.3%) of 400 goose cloacal swab samples taken from different farms in Kars center and districts between January and October 2020 and a pre-diagnosis of Campylobacter spp. was made. After mPCR analysis of the isolates, 151 (96.2%) were identified as C. jejuni and 6 (3.8%) as C. coli. 125 of the identified isolates were analyzed by MALDI-TOF MS. Thus, 119 (95.2%) of the isolates were confirmed as C. jejuni and 6 (4,8%) as C. coli, which was found 100% compatible with the mPCR. As a result of antimicrobial substance susceptibility tests, 53 (33.8%) of 157 isolates were found to be resistant to Ampicillin, 65 (41.4%) to Tetracycline, 118 (75.2%) to Ciprofloxacin, 19 (12.1%) to Gentamicin and 12 (7.6%) to Azithromycin. Among the resistant isolates, the relevant resistance gene positivity was detected by PCR; 19 (35.2%) for blaOXA61, 59 (90.8%) for tetO, 60 (50.8%) for gyrA and 10 (52.7%) for aphA. No ermB resistance gene was found among the isolates resistant to Azithromycin.Cloacal colonization of thermophilic Campylobacteria in geese has been found to be high in Kars region, which has an important share in goose breeding locally and traditionally. In Campylobacter infections, where the main contamination is mediated by contamination with feces and consumption of poultry carcasses that are not sufficiently heat-treated, the cloacal agent carriers of geese and their final dispersal with faeces may pose a risk to public health. Biosecurity practices to be carried out at the farm level, hygienic measures to be taken in the food production chain and periodic monitoring of the agents are predicted as moves that will reduce the incidence of human infections. In addition, determination of widespread antibiotic resistance among the isolates makes it important to choose the correct antibiotics for treatment and to limit the use of randomly antibiotic uses.Keywords: Campylobacter spp., goose, mPCR, MALDI-TOF MS, Antibiotic resistance