Test of biomaterials in biological systems

Abstract

öz Seramik, metalik, polimerik ve kompozit malzemeler genellikle biyomaizeme olarak kullanılmakta ve insan sağlığına önemli katkılarda bulunmaktadır. Biyomalzemelerin istenilen mekanik özellikleri yam sıra, bu malzemelerin biyouyumluluğu vücut parçalarının tedavisinde ve değiştirilmesine oldukça önemlidir. Yeni biyomalzemeler piyasaya çıkarılmadan önce, vücut içerisinde istenilmeyen bir etkiye neden olmamaları amacıyla detaylı biyolojik testlere tabi tutulmaktadırlar. İlk olarak vücut dışında daha sonra vücut içerisindeki testler yapılmalı, bunu takiben klinik denemelerle malzemenin biyolojik güvenilirliği ve performansı tespit edilmelidir. Bu çalışmadaki amacımız bazı biyomalzemeleri biyolojik sistemlerde incelemekti. Bu amaçla ilk olarak değişik kimyasal ve yüzey özelliklerine sahip seramik, metalik, polimerik ve seramik kompozit malzemelerin insan periferik kan mononüklear hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri trypan mavisiyle boyama metodu ile, periferik kan mononüklear hücrelerinin çoğalmaları üzerine etkileri bromodeoksiuridine'nin DNA'ya bağlanmasının tespiti ile ve mononüklear hücrelerin aktivasyonu MTT metoduyla incelenmiştir. Ayrıca, biyomalzemelerin inflamasyonda rol oynayan IL-la ve IL-6 sitokMerinin kan hücrelerinden salgılanmasını nasıl etkilediği ELISA kitleri kullanılarak araştırılmıştır. Seramik örneklerin değişik solüsyonlar içindeki çözünürlük özeüiMerinin aydınlatılmasında elektriksel iletkenlik ve pH değerlerindeki değişim baz alınmıştır. Test edilen biyomalzemelerin mutasyona neden olup olmadığı AMES testi ile Salmonella typhimurium susu kullanılarak ve anti- bakteriyel etkileri agar difüzyon yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Patojen bakterilerin biyomaizeme yüzeylerine adezyonunun tespiti için yüzeydeki bakteriler boyanmış ve optik mikroskop altında incelenmiştir. HA 800 °C peletleri dışında bütün test edilen malzemeler biyomaizeme içermeyen kontrollerle karşılaştnıldığmda pozitif sonuçlar göstermişlerdir. HA 800 °C peletleri hücre besiyeri içerisindeki çözünürlüğü ortamdaki iyon dengelerini etkileyerek mononüklear hücrelerin canlılığında, çoğalmasında ve aktivasyonunda azalmaya neden olmuştur. BSA ile kaplanmış HA 800 °C peletleri kaplanmamış HA 800 °C peletlerine oranla hücre canlılığını arttırmıştır. Parlatılmış metalik örnekler ve diğer metalik örneklerle polimerik örnekler 48 saat inkübasyonda yüksek hücre canlılığı oranları viigöstermişlerdir. 72 saatten sonra, büyük olasılıkla ortama salman iyon ve partiküllerden dolayı hücre canlılığında bir azalma tespit edilmiştir, özellikle 48 ve 72 saat inkübasyonlardan sonra, artan ekstrakt konsantrasyonu ile azalan oranda hücre canlılığı arasında bir korelasyon gözlemlenmiştir. Periferik kan mononüklear hücrelerinden sitokin salgılanması analizlerine göre HA 800 °C, HA-Alumina 1250 °C and HA-Zirkonya 1250 °C peletleri BL-la salgılanmasmda azalmaya neden olmuş, diğer yandan LPS ile tetiklenmiş hücrelerde BSA ile kaplanmış HA 1250 °C, alumina 1450 °C ve zirkonya 1450 °C peletleri kontrol kültürlerine ve BSA ile kaplanmış HA 800 °C paletlerine nazaran yüksek oranda IL-loc salgılanmasına yol açmışlardır. Paslanmaz çelik, titanyum alaşımı ve cirulene örneklerinde düşük oranlarda İL- la tespit edilmiştir. BSA ile kaplanmış HA 800 °C peletleri kaplanmamış HA 800 °C peletlerine oranla daha yüksek miktarda IL-6 salgılanmasına neden olmuşlardır. Metalik örneklerle inkübe edilen hücrelerde (LPS varlığında ve yokluğunda) düşük seviyede EL-6 salgılanması tespit edilmiştir. Mononüklear hücrelerin biyomalzemelerin varlığında çoğalmaları ve aktivasyonu incelenmiştir. Con A ile tetiklenen mononüklear hücrelerin çoğalması üzerinde HA 800 °C, HA-Alumina 1250 °C ve HA-Zirkonya 1250 °C ömeMerinin inhibisyon etkileri olduğu belklenmiştir. Mononüklear hücrelerin aktivasyonunda HA 800 °C ve HA 900 °C örnekleri bütün inkübasyon sürelerinde en düşük seviyede aktivasyona neden olmuşlardır. Bunun yam sıra, diğer seramik örnekler de 48 ve 72 saat inkübasyonlarda kontrollerden daha düşük oranda hücre aktivasyonu göstermişlerdir. Sadece 24 saatte ve düşük konsantrasyonlarda seramik ekstraktlan hücreleri aktive etmişlerdir. Çalışmamızda seramik örneklerin çözünürlük özellikleri belirlenmiştir. Sadece HA 800 °C peletleri hücre besiyerinin ve deiyonize suyun elektriksel iletkenliğinde yükselmeye neden olmuştur. Ayrıca, diğer örneklerde görülmemesine rağmen, HA 800 °C peletlerinin varlığında hücre besiyerinin ve deiyonize suyun pH değerlerinde az oranda yükselme tespit edilmiştir. Biyomalzemelerin PBS içerisindeki ekstraksiyonlannda Salmonella typhimvrium TAİOO susu üzerinde herhangi bir mutajenik etki mutajen madde (sodyum azid) ve negatif kontrol ile karşılaştırdığında gözlemlenmemiştir. Ayrıca, seramik, metalik ve polimerik örneklerin hem toz hem de pelet formlarının gram-negatif suşlar vm(E. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia, Proteus spp.) ve gram-pozitif suşlar (S. aureus and S. pyogenes) üzerinde herhangi bir anti-bakteriyel etkisi bulunmamıştır. Bakteri adezyonu çalışmalarında yüzey pürüzlülüğünün ve diğer yüzey özelliklerinin bakterilerin bağlanması, adezyonu ve biyofîlm oluşturmalarında önemli roller oynadığı sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak, düşük sıcaklıkta sinterlenmiş örnekler hücre canlılığında azalmaya neden olmasına rağmen bütün test edilen malzemeler vücut dışındaki biyouyumluluk değerlendirmeleri için pozitif sonuçlar vermişlerdir.

ABSTRACT Ceramic, metallic, polymeric and composite materials are generally used as biomaterials in order to improve human health. In addition to desired mechanical properties of biomaterials, biocompatibility is important in the treatment or replacement of body parts. Prior to the introduction of new biomaterials to the market, detailed biological tests are carried out to prevent any undesired side effects in the body. Both in vitro and in vivo tests are applied initially which is followed by the evaluation with clinical trials of the biological safety and performance. The aim of this study was to examine some biomaterials in biological systems. For this purpose, the effects of ceramic, metallic, polymeric and ceramic composite materials with different chemical and surface properties on the viability of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by trypan blue exclusion method, on the proliferation of PBMC by incorporation of bromodeoxyuridine to DNA in the proliferating cells and the activation of PBMC by MTT test were investigated. Furthermore, the effects of biomaterials on the secretion of proinflammatory cytokines (IL-la and IL-6) from PBMC were examined by using ELISA kits. The alteration of conductivity and pH in different solutions were determined to elucidate dissolution properties of ceramic pellets. In addition, AMES test (Salmonella typhimurium reverse mutation test) for the determination of mutagenic potentials and the agar diffusion method for examination of anti-bacterial effects of biomaterials were applied. Adhesion of pathogenic bacteria to the surface of biomaterials was investigated by staining bacteria and examining under the optical microscope. Except for HA 800 °C pellets, all samples showed positive results for biocompatibility compared to the controls without biomaterials. The dissolution of HA 800 °C pellets in the culture medium changed the ionic environment that led to a decrease in the viability, proliferation and activation of PBMC. However, BS A-coated HA 800 °C pellets increased the cell viability with respect to uncoated HA 800 °C pellets. Polished metallic samples and other metallic and polymeric samples showed high percent cell viabilities during 48 hours. After 72 hours, most probably because of released ions and particles to the environment, a decline in the viabilities of PBMC was determined. A negative correlation between increasing extract concentration and the cell ivviability was observed for all ceramic samples especially after 48 and 72 hours treatments. Cytokine secretion analysis after treatment of PBMC with biomaterials indicated that HA 800 °C, HA-Alumina 1250 °C and HA-Zirconia 1250 °C pellets led to a decrease in IL-loc secretion and BSA-coating of HA 1250 °C, alumina 1450 °C and zirconia 1450 °C resulted in higher levels of IL-la with respect to the control and BSA- coated HA 800 °C pellets in the presence of LPS. Stainless steel, titanium alloy and cirulene pellets caused low levels of IL-la secretion. In addition, BSA-coated HA 800 °C pellets increased IL-6 secretion compared to uncoated pellets. In metallic samples, low BL-6 levels were obtained with and without LPS stimulation. Moreover, the proliferation and activation of PBMC in the presence of biomaterials were evaluated. HA 800 °C, HA-Alumina 1250 °C and HA-Zirconia 1250 °C samples had inhibitory effects on the proliferation of PBMC in the presence of Con A. In the activation of PBMC, HA 800 °C and HA 900 °C samples showed the lowest values at all incubation periods. Moreover, other ceramic samples showed lower cell activation than the control cultures after 48 and 72 hours treatments. In addition, the cell activation was observed at 24 hours after treatment with the ceramic extracts at low concentrations. Furthermore, investigation of dissolution properties of ceramic samples indicated that only HA 800 °C pellets led to significant increases in the conductivity of cell culture medium and deionized water. Moreover, a slight increase in the pH levels of solutions was obtained in the presence of HA 800 °C samples, but not in the other samples. Finally, none of the extracts of biomaterials in PBS had mutagenic effect on Salmonella typhimurium TA100 strain when mey were compared to the mutagenic material (sodium azide) and the negative controls. In addition, all tested ceramic powders, ceramic pellets, metallic and polymeric materials had no anti-bacterial effects on both gram-negative strains (E. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia, Proteus spp.) and gram-positive strains (5. aureus and S. pyogenes). In bacterial adhesion studies, it was found that surface roughness and other surface properties play important roles for attachment, adhesion and formation of biofilm by bacteria on the surface of material. As a result, although the ceramic samples sintered at low temperatures resulted in adecrease in the viability of PBMC, all tested biomaterials showed positive results for in vitro biocompatibility evaluation. VI