Isolation of bacillus thuringiensis and investigation of crystal protein genes

Abstract

.a oz Bacillus thuringiensis yaygın olarak yeryüzünün her kısmında bulunabilen, gram-pozitif ve spor oluşturan bir bakteridir. Spor oluşumu sırasında, böceklere karşı toksik, hücre içi kristal proteinleri (cry proteinleri) sentezler. İnsektisidal aktivitesinden dolayı, yaklaşık olarak elli yıldan beri Lepidopteraların, Coloepteraların, ve Dipteraların arasında bulunduğu böcek gruplarını kontrol altında tutmak amacıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, başka böcek gruplarını kontrol altında tutmak ve mevcut böceklerin bu tür ilaçlara karşı geliştirdiği dirence alternatif olarak, yeni kristal proteinlerinin araştırılması gereklidir. B. thuringiensis tiklerinin genetiksel çeşitliliği izole edildikleri bölgelere bağlı olarak farklılık göstermektedir. Böylelikle, her bir habitat amaçlanan böcek gruplarına toksik etki gösteren yeni B. thuringiensis türlerini barındırabilir. Bu çalışmanın amacı, farklı ortamlardan B. thuringiensis türlerinin izole edilmesi ve bu izolatların içerdikleri kristal protein genlerinin saptanmasıydı. Topraktan, depo tozlarından, böcek ölülerinden ve kuru yapraklardan oluşan altmış beş örnek, Akhisar/Manisa, İzmir, ve Ereğli/Konya'dan toplandı. B. thuringiensis izolasyonu için sodyum asetat seleksiyonu, sıcaklık uygulaması ve endospore boyama yöntemlerine başvuruldu. B. thuringiensis türlerinin içerdikleri kristal protein genlerinin karakterizasyonu için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) uygulandı. Farklı ortamlardan izole edilen B. thuringiensis türlerinin hangi tip kristal geni taşıdığının belirlenmesi için cry 1, cry 2, cry 3, ve cry 9 kristal genleri için spesifik universal primerler kullanıldı. Buna ek olarak, elde edilen izolatların B. thuringienis olduğunu teyit etmek için 16S rRNA based PCR-restriction length polymorphisim (RFLP) metodu kullanıldı. Son olarak, elde edilen izolatların kristal protein profillerinin tespiti için SDS-PAGE metodu optimize edildi. 349 izolattan 136 tanesinin B. thuringiensis' t benzer koloni morfolojisi gösterdiği ve subterminal pozisyonda endospore içerdiği bulundu. 100 izolat PCR metodu ile tarandı ve 18 tanesinin cry geni (5 cry 1, 3 cry 3, ve 10 cry 9) taşıdığı belirlendi. Bununla birlikte, hiçbir izolatta cry 2 geni tespit edilmedi. Pozitif 18 izolatın 16S rRNA based PCR-RFLP ile taranması sonucunda, tip türlerle birlikte aynı restriksiyon profilleri elde edildi ki, bu da 18 izolatın B. thuringiensis olduğunu gösterdi. Bu izolatların Cry 9 proteinleri için SDS-PAGE ile yapılan çalışmalarda B. thuringiensis tip türünden farklı kristal proteini profili elde edildi.

ABSTRACT Bacillus thuringiensis is a ubiquitous, gram-positive and spore-forming bacterium. During sporulation, it produces intracellular crystal proteins (cry proteins), which are toxic to insects. Because of its insecticidal activity, it has been used for nearly fifty years to control certain insect species among the orders Lepidoptera, Coloeptera, and Diptera. However, it is still necessary to search for more toxins to control other insect orders and to provide alternatives for coping with the problem of insect resistance. The genetic diversity of B. thuringiensis strains shows differences according to the regions where they were isolated. Thus, each habitat may contain novel B. thuringiensis strains, which have some toxic effects on target spectra of insects. The aim of this study was to isolate B. thuringiensis strains from different environments and to identify the crystalline protein gene content of the isolates. Sixty five samples including soil, stored product dust, insect cadavers, and dry leaf residues were collected from Akhisar/Manisa, Izmir, and Ereğli/Konya. Three approaches were applied for the isolation of B. thuringiensis: sodium acetate selection, heat treatment, and endospore staining. Polymerase Chain Reaction (PCR) method was used for the characterization of cry gene content of B. thuringiensis strains. The universal primers specific to cry 1, cryl, cry 3, and cry 9 genes were used to detect the type of cry gene carried by each environmental isolate of B. thuringiensis strains. In addition, 16S rRNA based PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) was carried out to confirm B. thuringiensis strains. Finally, SDS-PAGE analysis was optimized to detect protein profiles of crystal proteins obtained from B. thuringiensis isolates. It was found that, 136 öf 359 isolates showed B. thuringiensis-like colony morphology and subterminal endospore position. One hundred isolates were screened by PCR and 18 of them were found to contain cry genes (5 cry 1, 3 cry3, and 10 cry 9). However, the cry 2 gene was not detected from any isolates. 16S rRNA based PCR- RFLP for 18 isolates gave the same restriction partem as positive controls, indicating that all 18 isolates were B. thuringiensis. SDS-PAGE studies for Cry 9 proteins of the isolates exhibited different protein profile from positive control of B thuringiensis strain.