Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from raw milk

Abstract

öz Laktik asit bakterileri, çeşitli gıdaların üretiminde starter kültür olarak kullanılmaları, antimikrobiyal maddeleri üretmeleri ve probiyotik ürünlerin formülasyonlarında yer almaları bakımından endüstriyel açıdan büyük öneme sahiptir. Çiğ süt, geleneksel yöntemlerle, ticari starter kültür kullanılmadan üretilmiş peynirler ve kefir gibi ülkemizde üretilen birçok süt ürünü yeni laktik asit bakteri suşları için iyi bir kaynak teşkil etmektedir. Bu laktik asit bakteri suşları, tat ve aroma özelliği bakımından farklı fermente süt ürünlerinin elde edilmesinde büyük potansiyele sahip olabilirler. Bu nedenle laktik asit bakterilerinin doğal kaynaklardan izolasyonu ve tanımlanması büyük önem taşımaktadır. Uzun zamandan beri, laktik asit bakterilerinin tanımlanmasında çeşitli fenotipik yöntemler kullanılmaktadır. Ancak, bu metotlar, bir genus içindeki alt türleri ve suşları etkin bir şekilde ayırt etmede çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Bu yüzden genotipik özelliklere dayanan yeni metotlar geliştirilmiş ve bakterilerin etkin bir şekilde tanımlanmasında kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada, laktik asit bakterilerinin çiğ inek sütünden izolasyonu yapılarak, biyokimyasal testler, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan metotlar ve `pulsed field` jel elektroforezi (PFGE) uygulanarak tanımlanması amaçlanmıştır. Laktik asit bakterileri çiğ inek sütünden izole edilmiş ve ilk önce biyokimyasal testlerle tanımlanmıştır. Daha sonra polimeraz zincir reaksiyonuna dayanan iki metot, ITS-PCR (`Internal Transcribed Spacer-PCR`) ve PCR-RFLP (`PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism`), referans laktik asit bakteri suşlarının tanımlanması için kullanılmıştır. 16S rRNA geninin çoğaltılması ve restriksiyon enzimiyle kesilmesine dayanan PCR-RFLP metodunun tanımlama için uygun bir metot olduğu kanısına varılmıştır. PCR-RFLP metoduyla, çiğ sütten elde edilen 13 izolat Lactococcus lactis, 24 izolat Enterococcus spp. ve 2 izolat da Lactococcus lactis subsp. cremoris olarak belirlenmiştir. Ayrıca PFGE, referans kültürlerin tanımlanması için optimize edilmiştir. Genomik DNA' nın Sma I restriksiyon enzimi kesilmesi sonucu elde edilen fragman profilleri Lactococcus, Enterococcus ve Streptococcus thermophilus referans suşlarının tanımlanmasını mümkün kılmıştır.

ABSTRACT Lactic acid bacteria are industrially important because they are used as starter cultures in food production, they produce antimicrobial compounds and they are used in the formulation of probiotic products. Several dairy products such as raw milk, traditionally fermented cheese (produced without the use of commercial starter cultures), and kefir which are produced in country are good sources of novel lactic acid bacterial strains. These lactic acid bacterial strains may have potential for the production of new fermented dairy products with characteristic aroma and flavour. Therefore, the isolation of lactic acid bacteria from natural products and their identification are important. For many years, several phenotypic methods have been used to identify lactic acid bacteria, but they are not often capable of effectively differentiating subspecies and strains within a genus. New methods based on the genotypic properties have been developed and used for the proper classification of bacteria. The aim of this research was the isolation of lactic acid bacteria from raw milk and the identification of the lactic acid bacterial isolates by biochemical tests, polymerase chain reaction (PCR)-based methods and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Lactic acid bacteria were isolated from cow's raw milk and identified by biochemical reactions. Two PCR based methods, ITS-PCR (Internal Transcribed Spacer-PCR) and PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism) were then used for the differentiation of reference strains of lactic acid bacteria. PCR-RFLP method, based on the amplification and restriction digestion of 16S rRNA gene, was found to be useful for the identification. Thirteen raw milk isolates were identified as Lactococcus lactis, 24 as Enterococcus spp., and 2 as Lactococcus lactis subsp. cremoris by PCR-RFLP method. Pulsed field gel electrophoresis was also optimized for the identification of reference strains. Restriction profiles obtained by digesting the genomic DNA with Sma I enabled differentiation of the reference strains of Lactococcus, Enterococcus, and Streptococus thermophilus.