Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from cheese

Abstract

öz Endüstriyel peynir üretimi özel olarak seçilmiş starter kültürleri gerektirmektedir. Bu starter kültürler başlıca laktik asit bakterilerinden (LAB) oluşmaktadır. Starter LAB peynir üretiminde pek çok fonksiyona sahiptir. Fermentasyon prosesi boyunca laktik asit üretirler ve pıhtının oluşmasının sağlamaktadırlar. Ayrıca, proteolitik aktivite göstermekte, aroma bileşikleri ve de antimikrobiyal madde üretiminde rol oynamaktadırlar. LAB bioçeşitliliğinin ve de geleneksel peynir çeşitliliğinin kaybolmasını önlemek için, geleneksel peynirlerden yeni laktik asit bakterilerinin tanımlanması önemlidir. Bu projenin amacı, geleneksel `Çömlek Peyniri` fermentasyonuna dahil laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve tanımlanmasıdır. Bu amacı gerçekleştirmek üzere, laktik asit bakterileri izole edilmiştir ve fenotipik ( hücre morfolojisi, Gram boyama, fizyolojik ve biyokimyasal testler) ve de genotipik (`PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism`) metodlar kullanılarak karakterize edilmiştir. Ayrıca, izolatların laktik asit üretme profilleri monitor edilerek teknolojik karakterizasyon gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonunda, toplam 113 kok ve 21 mezofıl laktobasil elde edilmiştir. Kok şeklindeki izolatların 54 adedi laktokok ve 59 adedi enterokok olarak bulunmuştur.Tür düzeyindeki ileri tanımlama göstermiştir ki; tüm laktokok izolatlar L. lactis ssp. lactis,dir ve enterekokların 30'u E.faecium, 8'i E.faecalis, 3' ü E. avium, T si E. durans ve 16 'sı Enterococcus ssp. olarak tanımlanmıştır. Laktobasil izolatları Lb. paracasei ssp paracasei (3 izolat), Lb. casei (3 izolat) ve Lactobacillus ssp. (15 izolat) olarak tanımlanmıştır. 16S rRNA-ITS genlerinin amplifıkasyonuna ve Taq I ve Hae III endonükleazları ile restriksiyonuna dayalı PCR- RFLP (`PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism`) metodu, ileri tanımlama için faydalı bulunmuştur. Son olarak izolatların asit üretme profilleri göstermiştir ki; 35 izolat, UHT yağsız sütün pH sini 30 °C de 6 saat inkubasyon sonunda 5.3 ün altına düşürebilmiştir ve bu izolatlar endüstriyel uygulama için en iyi starter adayları olmuştur.

ABSTRACT Specially selected starter cultures are required for the industrial production of cheese. These starter cultures are mainly composed of lactic acid bacteria (LAB). Starter LAB have many functions in cheese production. They produce lactic acid during the fermentation process and provide formation of the curd. Futhermore, they show proteolytic activity and also they play a role in the production of aroma compounds and antimicrobial substances. In order to prevent loss of LAB biodiversity and loss of traditional cheese diversity, it is important to identify novel LAB from traditional cheese. The aim of this project was to isolate and identify natural LAB flora involved in traditional `Çömlek Peyniri` fermentation. In order to achive this goal, LAB were isolated and characterized by using phenotypic ( cell morphology, Gram staining, physiological and biochemical tests ) and genotypic methods (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism). Moreover, technological characterization was performed by monitoring the acid production profiles of the isolates. At the end of the study, a total of 1 13 coccal and 21 mesophilic lactobacilli were obtained and maintained for future use. It was found that cocci shaped isolates included 54 lactococci and 59 enterecocci. Further identification at the species level indicated that all of the lactococci isolates were L. lactis ssp. lactis. Thirty of the enterecocci were E. faecium, 8 of them were E. faecalis, 3 of them were E. avium, 2 of them were E. durans and 16 of them were other Enterococcus ssp. Lactobacilli isolates were identified as Lb. paracasei ssp. paracasei (3 isolate), Lb. casei ( 3 isolate ) and other Lactobacillus spp (15 isolate). PCR-RFLP method which is based on the amplification of 16S rRNA- ITS genes and restriction digestion with Haelll and Taql endonucleases was found to be useful for further identification. Finally, acid production profiles of isolates indicated that 35 of the isolates could lower the pH of UHT skim milk below 5.3 for 6 h incubation at 30 °C and these isolates were therefore the best starter candidates for industrial applications.