Production of commercially suitable pectin methylesterase and polyphenol oxidase from agro-industrial wastes

Abstract

oz Bu çalışmada pektin metilesteraz (PME) ve polifenol oksidaz (PPO) enzimlerinin sırasıyla portakal kabuklan ve mantar saplarından eldesi için pratik ve etkili olabilecek ekstraksiyon ve kısmi saflaştırma prosedürleri geliştirilmiştir. Ayrıca enzimlerin bazı karakteristikleri de incelenmiş ve sıvı veya liyofilize haldeki stabil preparation da hazırlanmıştır. Çalışmada Valencia portakal kabuklarında kayda değer miktarda PME aktivitesi tesbit edilmiş (300-350 mL NaOH/dak/100gr) ve bu aktivitenin sezon boyunca en az 5 ay stabilitesini koruduğu belirlenmiştir. Portakal kabuklarında bulunan enzim, hücre duvarına iyonik olarak bağlı olup su ile ekstrakte edilememekte, ancak buna karşın kabuklann su ile birkaç kez homojenizasyonu ve filtrasyonuyla elde edilen kitleden uygun oranda NaCl ilavesi (10 gr/100 gr ekstraksiyon kanşımı) ve kanştırma ile (200 rpm'de 30 dak) etkili bir şekilde ekstrakte edilebilmektedir. Portakal kabuklanndaki PME aktivitesinin yaklaşık yansı ısıya dirençli, yansı da ısıya duyarlı enzim fraksiyonlarından oluşmakta olup, ısının enzim üzerinde aktive edici bir özelliği belirlenememiştir. Enzim ekstraktına 1 mM CaCİ2 ilavesi ile zayıf bir aktivasyon (yaklaşık % 20) sağlanabilmekte, ancak buna karşın yüksek konsantrasyonlardaki CaCİ2 ilavesi inhibe edici özellik göstermektedir. % 0.1 Na-benzoat ve % 0.1 K-sorbat ile stabilize edilmiş ekstraktlardaki PME aktivitesi + 4 °C'de yaklaşık 5 ay stabildir (% 90'm üzerinde aktivitesini korumaktadır). Buna göre portakal kabuğundan elde edilen PME'nin ticari preparatlarının sıvı formda hazırlanmasında herhangi bir salanca bulunmamaktadır. Bu çalışmada hazırlanmış olan PME preparatı narenciye pektininden yenilebilir film üretiminde başanlı bir şekilde kullanılmıştır. Diğer yandan, PPO'nun ekstraksiyonu için öncelikle mantar saplan aseton tozuna işlenmiştir. Aseton tozlan daha sonra Na-fosfat tamponu ile ekstrakte edilmiş ve % 90 amonyum sülfat çöktürmesi ya da 2-kat aseton çöktürmesi ve bunu takip eden diyaliz işlemi ile kısmi olarak saflaştınlrnıştır. Aynı aseton tozundaki PPO'nun monofenolaz aktivitesinin, amonyum sülfat veya asetonla çöktürme yoluyla kısmi safiaştınlması ile elde edilen geri kazanım ve saflık katsayılan sırasıyla % 74-86 ve 3.4- 4.3 ve % 55-67 ve 5.4-6.2'dir. Buna göre amonyum sülfat çöktürmesinin daha yüksek verime karşın daha düşük saflık sağladığı görülmektedir. Kısmi olarak saflaştınlmış PPO enziminin monofenolaz aktivitesinin ısıl direnci düşük olup inaktivasyonu 45 °C'ın üzerinde başlamaktadır. Enzim, pH 6.0 ve 8.0 arasında optimum aktivite göstermiş olup pH 7.0 ve 8.0'deki stabilitesi maksimumdur. Ancak buna karşın enzim, pH 4.0'te 24saat inkübasyon sonucunda aktivitesinin büyük kısmını kaybetmiştir. Enzimin optimum sıcaklığı 40 °C olarak belirlenmiştir. PPO enziminin monofenolaz aktivitesi, aseton tozu halinde + 4 °C'de stabilite göstermemiş, ancak buna karşın - 18 °C'de iki ay süreyle % 60-70 oranında aktivitesini korumuştur. Ayrıca amonyum sülfat ve diyaliz ile kısmi saflaştolmış ve destek maddesi olarak dekstran ve sakkaroz eklenerek liyofilize edilmiş PPO, -18 °C'de 3 ay süresince monofenolaz ve difenolaz aktivitesini korumuştur. Dekstranla liyofîlizasyonun enzimin ısıl stabilitesi üzerinde herhangi bir etkisi belirlenememiştir. Ancak buna karşın dekstranla liyofilizasyon, pH 4.0'deki monofenolaz aktivitesinin stabilitesini kısmen azaltmıştır. Tirozin üzerindeki monofenolaz aktivitesi ve L-DOPA üzerindeki difenolaz aktivitesinin yanısıra dekstranla liyofilize edilmiş PPO, floridzin'i de substrat olarak kullanabilmektedir. Bu sonuç enzimin antioksidan ve renk maddelerinin üretimi, proteinlerin modifikasyonu, kakao ve siyah çayın fermantasyonu gibi farklı gıda uygulamalarında kullanılabileceğini göstermektedir. vn

ABSTRACT In this study, some simple and effective extraction and/or partial purification procedures were developed to obtain pectin methylesterase (PME) and polyphenol oxidase (PPO) enzymes from orange peels and mushroom stems, respectively. Also, some characteristics of enzymes were investigated and their stable preparations were obtained in liquid or lyophilized forms. Valencia orange peels contain considerable PME activity (300-350 mL NaOH/min/100 g) that is quite stable during season for at least 5 months. The enzyme was ionically bound to cell walls and can not be extracted by homogenization with water. However, the addition of suitable amounts of NaCl (10 g /100 g extraction mixture) to pellet, obtained by homogenization of peels several times with water, and 30 min mixing (at 200 rpm) may be effectively used to extract the enzyme. The PME in orange peels contains almost the same amount of heat stable and heat labile fractions and the enzyme can not be activated by mild heating. A slight activation (almost 20 %) may be achieved by adding 1 mM CaCk to enzyme extracts. However, at higher concentrations the addition of CaCk was inhibitory. The PME activity in extracts, stabilized by use of 0.1 % Na-benzoate and 0.1 % K-sorbate, is stable almost 5 months at + 4 °C (maintains > 90 % of its activity). Thus, the commercial preparations of enzyme may be obtained in liquid form. The extracted PME was successfully used to prepare edible films from citrus pectin. For the extraction of PPO, on the other hand, mushroom stems were first processed to acetone powder. The acetone powders were then extracted with Na- phosphate buffer and partially purified with ammonium sulfate (90 % saturation) or acetone precipitation (2-fold). Following dialysis, the recoveries and purification folds obtained from the partial purification of monophenolase activity of PPO from the same acetone powder were 74-86 % and 3.4-4.3 and 55-67 % and 5.4-6.2 for ammonium sulfate and acetone precipitations, respectively. Thus, it appears that the ammonium sulfate precipitation gives a higher yield but lower purity. The monophenolase activity of partially purified PPO is heat labile and showed inactivation above 45 °C. The enzyme exhibited a pH optimum between pH 6.0 and 8.0. The pH stability of enzyme was maximal at pH 7.0 and 8.0. However, at pH 4.0 the enzyme lost most of its activity after 24 h incubation. The optimum temperature of enzyme was found as 40 °C. The monophenolase activity of PPO enzyme showed no stability in acetone powders at + 4 °C. However, it showed good stability at -18 °C for two months with retention of60-70 % of its activity. The PPO partially purified with ammonium sulfate precipitation and dialysis, and lyophilized by using dextran or saccharose as supporting materials also retained its monophenolase and diphenolase activities for three months at -18 °C. The effect of lyophilization with dextran on temperature stability of enzyme was insignificant. However, lyophilization with dextran reduced the pH stability of monophenolase activity at 4.0 moderately. In addition to its monophenolase activity on tyrosine and diphenolase activity on L-DOPA, PPO lyophilized with dextran can also use phloridzin as substrate. Thus, it appears that the enzyme may be used in different food applications including the production of antioxidants and colorants, modification of proteins, fermentation of cocoa and black tea, etc.