Generation of improved E.coli strains to be used in the construction of ligand libraries

Abstract

ÖZET Ligand (Peptide) Kütüphanenelerinin yapımınındaki ilk adım, milyonlarca ligand varyantlarını kodlayan gen fragmanlarının, seçilmiş plasmid vektörlere total olarak klonlanmasıdır. Ligand proteinler, plasmid vektörde bulunan faj pul filament proteiniyle füzyon olarak eksprese edildiklerinden, bakteride yeni faj partiklerinin yapısına girerler. Faj partiküllerini oluşturan proteinler de ligand DNA klonlannı içeren bakterilerin yardımcı fajlarla (helper phage) super-enfeksiyonu ile sağlanır. Ligand kütüphanelerin zenginliği, içerdikleri farklı gen fragmanları sayısıyla doğru orantılıdır. Faj displey yönteminin şu anki durumuyla, kütüphane diversitesini negatif yönde etkileyebilecek bazı yönleri vardır. Bunlardan bir tanesi, super-enfeksiyondan sonra oluşan faj partiküllerini teorik olarak yansının, spesifik bir ligandı taşıdıkları halde ligand geninin bulunduğu plasmidin yerine yardımcı fajın genomunu taşıyor olmalarından kaynaklanmaktadır. Bu fajlar hem bir ligandı hem de genini taşıyan fajlarla, seçim sırasında rekabet ederler ve bir sonraki seçim sırasında taşıdıkları ligandı da kaybederler. Bu durum, herhangi bir kütüphanede en az sıklıkta temsil edilen fakat fonksiyon bakımından büyük öneme sahip olabilecek ligandların ardışık seçim aşamalarında kaybolmalarına neden olmaktadır. Diğer bir dezavantaj, süper-enfeksiyon sırasında veya sonrasında yardımcı faj tarafından enfekte olan bir bakterinin yeniden enfeksiyona uğramasıdır. Bu da, ligand taşımayan faj partiküUerinin sayıca artması nedeniyle, ligand DNA' sim taşıyan faj partiküllerinin popülasyondaki sıklığını azaltır. Faj gösterim yönteminde, bu iki dezavantaj faj süper-enfeksiyonundan kaynaklanmaktadır. Bu çalışma DNA replikasyono için gerekli olan genler arası bölgeyi içermeyen Mİ 3 genomunu yardımcı faj kullanımı yerine E.coli kromozomuna ekleyerek bu sürecin faj displey yönteminden eliminasyonunu öngörmektedir. Bu amacı gerçekleştirmek için Homolog rekombinasyon methodu kullanıldı. Bu metod bacterinin kromozomundaki genlerin değiştirilmesi silinmesi ve eklenmesi için kullanılan in vivo bir methottur. Homolog recombinasyondan sonra, 3 koloni gözlenmiş ve bazı doğrulama testlerine maruz bırakılmıştır. Bu testlerin ilk adımı rekombinasyon kasetinde bulunan belirli genlerin varlığını doğrulamaya ilişkindir. Elde ettiğimiz sonuçlar bazı genlerin kromozom üzerinde bulunduğunu göstermiştir. Fakat, Mİ 3 genlerinin E.coli kromozomunun üzerindeki fonksiyonları belirlenmemiş Mİ 3 genlerinin toxic etkisi nedeniyle fonksiyonlarım kaybetmeye neden olan kromozoma! yeniden düzenlemeyle sonuçlanmıştır.

ABSTRACT The first step in the construction of ligand libraries is the total cloning of gene fragments coding millions of ligand variants into selected plasmid vectors. Since ligand proteins are expressed in fusion with the phage pill protein, they can be incorporated into the newly synthesized phage particles in bacteria. The other proteins that make up the phage particle are supplied by the super infection of bacteria containing the ligand DNA clones with the helper phage. The diversity of the ligand libraries is directly proportional to the number of different gene fragments. In the current phage display technology, there are some drawbacks which can dramatically influence the diversity of a given ligand library. One of the drawbacks arises from the fact that, theoretically half of the phage particles, which are produced after super-infection, can carry only the helper phage genome instead of the ligand gene, even though they display a specific ligand protein. These phages can compete with those which carry both the ligand gene and its protein during the selection process and consequently they loose the ligand protein during the second round of selection. In any given library, this problem can cause the loss of rare but functionally very important ligands during the sequential selection procedure. Another drawback is the reinfection of a super-infected bacteria during or after the super-infection. This can increase the frequency of those phage particles which only carry the helper-phage genome, in the total phage population. These two disadvantages in the phage display technology are due to super-infection. This study aimed at the elimination of the super-infection step from the phage display technology by the insertion of Ml 3 phage genome excluding intergenic region which contains the DNA sequences necessary for replication instead of uses of helper phage. To accomplish this purpose, Homologous Recombination method was used. It is an in vivo method for the replacement, deletion or insertion of sequences in bacteria. After Homologous Recombination, three colonies were observed and observed colonies were exposed some confirmation tests. First step of these tests was related to the presence of unique recombination cassette sequences in chromosomal DNA. Results we obtained showed that the presence of such fragments in chromosomal DNA. However, the functional test of the Ml 3 genes in E.coli chromosome suggested the toxicity of an unidentified Ml 3 gene products on E.coli chromosome IV