Biocatalytic performance of carbonic anhydrase immobilized within polyurethane foam in water-miscible organic solvents

Abstract

Asetonitril ve etanol gibi suyla karışabilen organik çözücülerin serbest ve immobilize edilmiş karbonik anhidraz enziminin aktivitesine etkileri araştırıldı. Karbonik anhidraz enzimi, poliüretan sünger içerisine kovalent çapraz bağlanma ile immobilize edildi. Poliüretan sünger kendi ağırlığının yaklaşık 12 katı kadar su tutabilmesine rağmen, poliüretan süngerin üzerindeki nemin adsorpsiyon izoterminin, Tip III adsorpsiyon izotermi olduğu bulundu ve bu durum, poliüretan sünger ile suyun birbirleriyle çok az etkileştiğini gösterdi. Serbest ve immobilize karbonik anhidraz enziminin aktiviteleri, substrat olarak para-nitrofenil asetat kullanılarak ölçüldü. Enzim aktiviteleri, Tris tampon çözeltisindeki organik çözücünün hacimsel yüzdesi arttırılarak hesaplandı (%10-90). Para-nitrofenil asetatın hidroliz reaksiyonu ürünlerinden biri olan para-nitrofenol, organik çözücülerde karakterize edildi. Para-nitrofenolün absorptivitesinin, karışımdaki organik çözücü yüzdeleri arttırıldığında önemli ölçüde düştüğü gözlemlendi. Bu durum, para-nitrofenol ve suyla karışabilen organik çözücülerin daha çok hidrojen bağları ile kompleks bir yapı oluşturduğunu gösterdi. Serbest enzim, kritik organik çözücü yüzdelerine (%40-60) kadar aktivite düşüşü ve daha sonra, yüksek organik çözücü yüzdelerinde aktivite artışı gösterdi. İmmobilize enzim, %50'ye kadarki asetonitril yüzdelerinde aktivite düşüşü gösterdi ve daha sonra, yüksek asetonitril yüzdelerinde bütün aktivitesini kaybetti. %10'dan yüksek etanol yüzdelerinde ise immobilize enzim hiçbir aktivite göstermedi. Stabilite testlerinde immobilize enzim, %30'tan yüksek organik çözücü yüzdelerinde, çarpıcı bir biçimde kısa zamanda inaktive oldu. Sonuç olarak, suyla karışabilen organik çözücüler, enzimin aktif bölgesinin yapısını ciddi bir biçimde bozarak enzimi denatüre etti.

The effects of water-miscible organic solvents such as acetonitrile and ethanol on the activity of free and immobilized bovine carbonic anhydrase (CA) were investigated. The CA was covalently immobilized within polyurethane (PU) foam by cross-linking. Although PU foam holds water almost 12 times of its weight, it was found that adsorption isotherm of moisture on PU foam was a Type III indicating that water and PU foam were non-interacting to each other. The activities for the free and immobilized CA were estimated using para-nitrophenyl acetate (p-NPA) as the substrate. The enzyme activities were estimated in increasing volume percents of organic solvent in Tris buffer (10-90%). p-NP, which is one of the products of the hydrolysis reaction of p-NPA, was characterized in the presence of organic solvents and it was observed that its aborptivities were decreased significantly as the organic solvent percentages were increased indicating that p-NP and the water-miscible organic solvent form a complex through mostly a hydrogen bonding. The free CA showed decreasing activity up to critical percentages of organic solvent (40-60%), and then exhibited an increasing activity. The immobilized CA showed decreasing activity in acetonitrile at percentages up to 50%, and then lost its total activity at higher acetonitrile percentages, however, the immobilized CA exhibited no activity in ethanol at percentages above 10%. Stability tests showed that the immobilized CA was dramatically inactivated in the organic solvents at percentages above 30% in shorter times. It was concluded that the water-miscible organic solvents severely perturbed the active site of the enzyme, thus denaturating the enzyme.