Molecular recognition based self assembly of engineered proteins on nanoscaled gold surfaces

Abstract

Son zamanlarda, tıp ve teknolojiye yönelik geniş bir uygulama alanında, doğadanesinlenerek geliştirilen yeni malzemeler yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bubiyolojik malzemelerin çeşitli yapı ve işleve sahip olmalarında rol oynayananahtar unsurlardan bir tanesi hiyerarşik organizasyondur. Bu organizasyonunçok karmaşık olması nedeniyle söz konusu işlevlerin bire bir aynısının üretilmesibizim mühendislik yaklaşımlarımızla bile zordur. Moleküler-ölçek tanıma esasınadayalı biyolojik olarak kendiliğinden montaj olabilme ilkesi ise Doğa'nıntasarımındaki anahtardır. Bu mekanizma, biyolojik malzemelerde gördüğümüzkendiliğinden organizasyon ve kendiliğinden düzenlemeyi kolaylaştırmaktadır.Söz konusu mekanizmada rol alan en önemli etkileşim moleküllerinin ise çokyönlü olmalarından dolayı proteinler olduğu anlaşılmıştır. Proteinlerinkendiliğinden montaj olabilme yeteneği gelecekte Doğa'daki tasarımların bire birbenzerlerinin yapılmasında rol oynayabilir.Proteinlerin daha küçük yapıları olan peptidler de Doğa'daki gibi çok yönlülüğesahip yeni malzemelerin üretilmesinde önemli bileşenlerdir. Son zamanlardaanorganik malzemelere özgün olan peptidler yeni biyo-yüzey fonksiyonlaştırıcıajan olarak cazip hale gelmişlerdir. Yüzeyleri peptidlerle fonksiyonlaştırma,biyolojik moleküllerin malzeme yüzeyine tutunmasını artırabilmekte ve diğerfarklı malzemeler ile de kaplanmasını sağlamaktadır. Peptidlerin bu denlimodülerite olmaları onların aynı zamanda çok farklı işlevsel proteinlerle debirleştirilme imkanını sağlamaktadır. Bu çalışmada, güdümlü bir şekildekendiliğinden organizasyonu gerçekleştirme yeteneğine sahip işlevsel protein veenzimlerin, peptidlerle olan tasarımı ve rekombinant birleştirilmesine ilişkindetayları sunmaktayız.Bu tez kapsamında, ilk önce, altın yüzeylere biyolojik olarak kendiliğindenmontajı başarabilecek MBP-AuBP1 hetero-işlevsel yapı üretebilmek amacıyla,AuBP1 peptidini genetik yollarla iki farklı bağlayıcı kullanarak maltoz bağlayanprotein (MBP) ile birleştirdik. Yüzey plazmon rezonans (SPR), lokalize yüzeyplazmon rezonans (LSPR) gibi spektroskopik tekniklerle MBP-AuBP1 füzyonproteinin çeşitli altın yüzeylere bağlanma ve kendi kendine tutunma özelliklerinikarakterize ederek kanıtladık. Burada AuBP1 peptidi moleküler seviyedeanorganik-organik ara yüzeyini etkili bir şekilde kontrol ederek, MBP'nin altınyüzeye uygun bir konformasyonda organizasyonunu sağlamıştır. Dahası softlitografive kendiliğinden montaj tekniklerinin kombinasyonu ile AuBP1 peptidi,altın nanoparçacık dizilişlerin (array) üzerine yüksek moleküler yoğunlukta ve birtakım kolay ve tekrarlanabilir adımlardan sonra etkili bir motif oluşturarakproteinin montajını kontrol etmiştir. Bu model sistem spesifik AuBP1 aracılığıylakat-kat montajlama (layer-by-layer assembly) yeteneğini göstermektedir.İkinci tasarımımızda, altın bağlayan ikinci peptidimiz (AuBP2) ile kırmızıflüoresan protein olan DsRed-monomeri genetik füzyon tekniğiyle birleştirerekyeni, çok fonksiyonlu denetleme molekülü geliştirdik. Biyolojik görüntüleme,ilaç salınımı ve hedefe yönelik tanı mekanizmalarında kullanılmak üzere kendikendine montajlanan altyapı birimlerinin oluşturulması için AuBP2 özgün birbağlayıcı malzeme olarak nedeniyle kullanıldı. Ayrıca, AuBP2 peptidi çeşitlinano yüzeylerde fonksiyonel biyo-prob olarak kullanılacak olan altınınkullanıldığı malzemelerin tasarımında DsRed'in immobilize olabilmesi içinkullanıldı. AuBP2 aracılığıyla çok daha fonksiyonel DsRed-monomer üretilerekhem biyolojik algılama uygulamaları hem de analitik uygulamaları gösterilmiştir.DsRed'in kırmızı fluoresan özelliğinden dolayı fluoresan enerji transfer (FRET)uygulamalarında çok tercih edilmektedir. Çünkü nano ve mikro yüzeylerde çokavantajlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu nedenle bu çalışmamızda kırmızıflüoresan özellikli ve altın yüzeylere immobilize olabilen füzyon protein ürettik.Bununla birlikte DsRed füzyon proteininin bakır metaline bağlanma potansiyeliniaraştırdık. DsRed'in bakır iyonuna karşı olan bu ilgisi altın nanoparcacıklarla daincelenmiştir. DsRed-AuBP2 bakır iyonu ve altın nanoparcacıklarıyla flüoresanşiddeti azalmaktadır. Bu da bağlanma kinetiği hakkında bilgi vermektedir. Bakıriyonu ve altın nanoparcacıklarının teknolojik önemlerinden dolayı DsRedAuBP2'libiyosensor üretilmiştir. Bununla birlikte DsRed-AuBP2'nin nanofiberoluşumunda da yer alabileceğini gösterdik. Oluşturulan nanofiberler altınnanoparçacığı ve kırmızı flüoresan protein içermektedir. Burada DsRedAuBP2'ningörevi altın nanoparçacıklarının PEO (polietilenoksit) polimeriylederinlemesine etkileşimini sağlayarak fiber oluşumunun organizasyonunusağlamaktadır. Böylece çok yönlü ve iletken nanofiberler üretilmiştir.Son olarak altın bağlama aktivesi de olan bir füzyon enzim tasarladık. Formatdehidrogenaz (FDH), AuBP2 peptidiyle birleştirildi. Buradaki amaçla elektrokatalitik aktiviteyi ölçen devre tasarımında kullanılan bir biyoelektrot üretildi.FDH-AuBP2'nin altın yüzeye immobilize olmasıyla biyoelektrot oluşturuldu vebu elektrotu enzimin redoks aktivitesinin ölçülebileceği bir elektrik devretasarımında kullandık. Enzimin format substratını CO2' e dönüştürmesi,tasarlanan elektrik devresinde gözlenmiştir.Geliştirilen çok fonksiyonlu biyomoleküler yapıların kendiliğindenorganizasyonu gerçekleştirdiği ve işlevsel hiyerarşik hibrit birimlerin meydanageldiği kanıtlanmıştır. Ayrıca, anorganiklere bağlanan peptidler, enzimlerinyüzeylere oryantasyonunun kontrolünü yapmaktadır. Her bir peptid ve enzimsistemlerinin genetik birleştirmenin ardından kimerik işlevlerin performansınıaraştırmak için detaylı bir şekilde değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu tezdesunulan tüm bulgular ve sonuçlarla ürettiğimiz proteinleri kullanarak yeninanoyapılı malzemelerin oluşturulabileceği gösterilmiştir. Tasarladığımız çokfonksiyonlu proteinler altın yüzeylere yüksek affinite ve seçiciliklebağlanabilmektedir. Bundan dolayı protein tabanlı mikro/nano diziler,biyosensörler, biyopiller ve moleküler görüntüleme ve tanımlama sistemlerindekullanılmıştır. Anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin umut verici olan altyapıteknolojisi ve nano yapılı sistemlerdeki rolleri gösterildi. Bu amaçla metallereözgü flüoresan biyosensor, biyolojik pil üretimi için biyolojik elektrot ve iletkennanomat için nanofiber gibi nanoyapılar ürettik. Nano cihazların söz konusupeptid ve proteinlerden tasarlanması gelecekteki yöntemlere umut vadetmesine rağmen hala bir takım araştırılması gereken önemli hususlar vardır. Bu konuüzerinde sınırlı çalışmaların yayınlandığını gördük ve bu amaca yönelikrekombinant olarak, oldukça yüksek oranda üretilebilen, yeni protein yapıların(constructs) tasarlanmasına ilişkin sağlam bir strateji geliştirdik. Dahası, biyoaktifnanoyapılar oluşturmak için protein bileşiklerini kullanarak biyo-nanoteknolojikuygulamalara yönelik bir yaklaşım ileri sürdük. Bu yaklaşım yeni nano cihazüretimi için anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin proteinlerlebirleştirilmesidir. Bu üretim sürecinde kendi kendine tutunma tekniğini kullananve altına özgün bağlanan (AuBP1 ve AuBP2) peptidleri kullandık. Daha öncekiçalışmalarımızda gösterdik ki bu peptidler altın yüzeylere oldukça yüksek biraffinite ve seçicilikle bağlanmaktadır.Sonuçta, bu tez kapsamında geliştirilen proteinlerle yeni nano yapılımalzemelerin tasarlanabildiğini bu çalışmada yer alan bulgular göstermektedir.Geliştirdiğimiz çok işlevli proteinler uygun koşullar altında, nano ölçekten mikroölçeğe kadar çeşitli altın yüzeylere karşı yüksek bir bağlanma ilgisine veözgünlüğüne sahiptir. Bu yeni platformlar pek çok amaç için kullanılabilir.Örneğin, protein mikro/nano dizilişler, biyosensörler, biyobateriler ve molekülergörüntüleme ve hedefleme amacıyla kullanılacak belirteçler hazırlanabilir.Belirlediğimiz bu model, organizasyon, kaplama ve mimariyi kontrol edebilençeşitli protein dizilişleri, plazmon-aktif nanometalik montajlar ve cihazlarınüretilmesinde tamamen biyolojik bir yol izlemektedir.

In recent years, a wealth of novel, nature-inspired materials have been exploredacross a wide range application in medicine and technology. Hierarchicalorganization is one of the key components that are reflected in the diversestructure and function in biological materials. In mimicking these functions in ourengineering approaches have been challenging due to the complexity of theseorganization. Biological self-assembly principle based upon precise molecularscalerecognition is the key in Nature`s design. Biological machinery facilitatesself-organization and self-regulation that we observe in biological materials.Proteins are perceived as crucial interaction components in this machinery owingto their versatile characteristics. The protein assemblies may be the key in makingnext generation materials mimicking Nature`s design.Peptides as smaller domains of proteins become crucial components inconstructing new types of materials having the versatility that we observe inNature. Inorganic material specific peptides have attracted increasing interest inthe recent years as novel bio-surface functionalization agents. Suchfunctionalization can recruit biological cues to the material's surface and promotethe otherwise challenging coupling of distinct materials. Their modularity alsooffers a unique opportunity to link them to numerous other functional proteins.Herein, we provide the details for their design and recombinant incorporation intofunctional proteins and enzymes to achieve addressable self-organization.In the scope of this dissertation, we first constructed an AuBP1 peptidegenetically fused to the C-terminus of maltose-binding protein (MBP) using twodifferent linkers to produce MBP-AuBP1 hetero-functional constructs in order toaccomplish the biological self-assembly on gold surfaces. Using variousspectroscopic techniques, surface plasmon resonance (SPR), and localized surfaceplasmon resonance (LSPR), we verified the binding of MBP-AuBP1 fusionprotein on gold substrates. The AuBP1 peptide tag were demonstrated to directthe organization of recombinant MBP protein onto various gold surfaces viaefficient control of the organic–inorganic interface at the molecular level.Furthermore, using a combination of soft-lithography and self-assemblytechniques, AuBP1 peptide tag controlled the formation of protein assembliesonto gold nanoparticle arrays with high molecular packing density and patterningefficiency following a series of simple, reproducible steps. This model systemoffers layer-by-layer assembly capability upon specific AuBP1.In our second design, we developed multifunctional monitoring molecule throughgenetic fusion of gold binding peptide (AuBP2) to a red fluorescence protein, DsRed-Monomer. AuBP2 was utilized as a material specific linker to constructnovel bio-imaging, drug delivery, and targeting bio-nano hybrid systems. TheAuBP2c peptide tag was enabled the self-immobilization of the DsRed proteinonto a variety of nanoscale gold surfaces. Functional DsRed monomer generatedby protein engineering methods using AuBP2 allowed variety of properties forbiological sensing as well as analytical applications. The red emission of DsRedprotein offered new opportunities at the nano- to micro-scale of a material surfacesuch as multicolor labeling and fluorescence resonance energy transfer (FRET)applications. Our designed fusion protein with a fluorescent tag provided quickand accurate visualization of the self-immobilized proteins on the gold surface.Additionally, DsRed constructs have a selective and reversible binding affinity tocopper. This unique binding property of DsRed protein to copper ions and goldnanoparticles results in tunable quenching of its fluorescence activity. Given theimportance of gold nanoparticles and copper ions in several application areas,DsRed-AuBP2 was proposed as a bio-sensing modality through its bi-functionalproperties, fluorescence and self-assembly. We also tested the efficiency of theDsRed-AuBP2 protein as an integrated component in nanofiber system. Thefibers were formed in the presence of the protein provided the integration of goldnanoparticles along the fiber length through Au-binding peptide tag. Thesenanofibers that feature gold nanoparticles with proteins did not affect the redfluorescence property of the protein, rather protein allowed the visualization ofthe protein construct along the fibers. Engineering proteins that can decorate goldnanoparticles well integrated into PEO polymer fibers offers several opportunitiesto create versatile structural templates for metallization in formation ofconducting nanofibers.Our final set of design included a fusion enzyme that is designed to have goldbinding activity. Formate dehydrogenase, FDH, was fused to an AuBP2 fusiontag to construct FDH-AuBP2. This fusion enzyme was utilized to develop acircuit-based electrode system that provided verification of the redox catalyticability of the self-immobilized enzyme on gold electrode by subsequent additionof formate. We achieved this validation following the self-immobilization ofFDH-AuBP2 onto a gold electrode surface and monitored the conversion offormate to CO2 electrochemically. The circuit-based system we constructedconsisted of two gold electrodes submerged in a buffer solution. Prolongedcatalytic activity of the enzyme was observed by subsequent addition of formatinto solution.The engineered multi-functional biomolecular constructs developed weredemonstrated to self-organize, forming functional hybrid hierarchical entities.However, no all-encompassing solution exists to control the orientation of theenzymes on surfaces using inorganic binding peptide tags. Each peptide andenzyme system requires detailed evaluation following genetic conjugation toinvestigate the performance of the chimeric functions.Our results demonstrate the engineered inorganic binding peptides as a promisingplatform technology by their role in producing bi-hybrid nanostructured systemsincluding fluorescent biosensors for metals, bioelectrodes for biobatteries, andnanofibers for conductive nanomaterial. Based upon an in-depth investigation ofthe limited research currently published in this growing field, we have developeda strategy for the design of new protein constructs as well as their over-expressionas recombinant products. Moreover, we provide a valuable approach to generatebioactive nanostructures for the engineering protein complexes by co-expression,purification, and characterization, coupled with bionanotechnologicalapplications. Our engineering approach to conjugate proteins with inorganicbinding peptides to create nanodevices propels this technology forward, one stepcloser to becoming a reality. Our fabrication process is based upon a bio-enabledself-assembly technique and is, herein, proven capable for engineeringmultilayered protein and nanometallic assemblies that utilize modular goldbindingpeptides, such as AuBP1 and AuBP2.Overall, the reported findings in this dissertation demonstrate a great potential todesign novel nanostructured materials that incorporate the engineered proteinsthat are designed in the scope of this thesis. Our multi-functional engineeredproteins display high binding affinity and specificity to various gold surfaces atthe nano- to micro scale under ambient conditions. These novel platforms can beused for a variety of purposes such as preparing protein micro/nano-arrays,biosensors, biobatteries, and reagents for molecular imaging and targeting. Ourestablished model constitutes biological routes for biofabrication of variousprotein arrays, plasmon-active nanometallic assemblies, and devices that featurecontrolled organization, packing density, and architecture.