Regulatory effect of transcriptional factors ComK and SinR on the expression of bacABCDEywfG operon in Bacillus subtilis

Abstract

Bacillus subtilis, bitki büyümesini teşvik yeteneğine sahip bir rizosfer kolonizasyon bakterisidir. Ayrıca bitkideki patojen organizmaların büyümesini bastıran, patojenik olmayan gram pozitif çubuk şeklinde bir bakteridir. Farklı çevre koşullarında, toprakta ve bitki kökünün yüzeyi üzerinde büyüyebilir. Bacillus subtilis, genomunun tamamı dizilenmiştir. Ayrıca patojen özellikte olmaması sebebiyle kolay kontrol edilebilir bir türdür. Bölünme ve büyüme hızı, kolay transforme olabilme yeteneği, yüksek adaptasyon kabiliyeti, çeşitli antibiyotikleri, enzimleri ve biyokimyasalları üretebilmesi sayesinde bilimsel araştırmalarda sıklıkla yer alan bir model organizmadır. 4,2 Mbp uzunluğundaki genomunun tamamının dizilenmesi sonucunda, organizma genomunun yaklaşık 4,100 genin kodlanmasından sorumlu olduğu görülmüştür. Bu genlerin haritalanması ile türe özgü fonksiyonların gerçekleştirilmesinden sorumlu olan kısmın, toplam bakteri genomunun üçte birlik bir kısmı olduğu anlaşılmıştır. Haritadaki geri kalan üçte ikilik kısmın sahip olduğu fonksiyonları aydınlatma amacıyla yapılan çalışmalar hala sürmektedir. Bacillus cinsine ait mikroorganizmalar bazı önemli özellikleri nedeniyle gıda endüstrisinde biyolojik gıda kontrol ajanı olarak kullanılmaktadırlar. Bu özelliklerinin başında GRAS (Generally Recognized as Safe) etiketine sahip olmaları, toksisitelerinin düşük olması, biyo-bozunabilirliliğinin yüksek olması ve çevreye yararlı olmaları sıralanabilir.B. subtilis besin sıkıntısı nedeniyle hayatta kalmak için çeşitli stratejiler geliştirmiştir. Logaritmik büyüme fazının sonunda besin elementleri azaldığı zaman B. subtilis hücreleri ortamda besin elementleri aramayı kolaylaştırmak için karmaşık bir motilite ve kemotaksis sistemi geliştirmeye başlar. Beslenme kısıtlamaları devam ederse, hareket ederek besin bulmayı hedefleyen bakteride, bu sefer de ortamdaki diğer mikroorganizmaları bu yarıştan uzaklaştırmak için antimetabolik, antifungal ve antimikrobiyal özellikteki antibiyotiklerin üretimi tetiklenir. Besin kıtlığıyla baş edebilme çözümlerine ek olarak, aynı şekilde ortamdaki besin seviyesinde azalma söz konusu olduğunda, farklı besinleri kaynak olarak kullanabilmek için parçalayıcı enzim üretimine, kompetans geliştirerek yabancı DNA'nın hücre içine alımına ya da sporlanmaya yönelebilen B. subtilis, olumsuz şartlarda geliştirdiği çeşitli mekanizmalarla hayatta kalmayı başarabilen bir mikroorganizmadır.Bunun yanı sıra sahip olduğu kemotaksis kabiliyetinin sonucu olarak katı yüzeylerde kayarak yer değiştirebilmesi, olumsuz şartlarda sporlanması ve kompetans geliştirilmesi B. subtilis türünü, rakipleriyle mücedelesinde öne çıkaran avantajlar arasındadır. Aynı şekilde, hücreler muhtemel rakipleri ile mücadele etmek için antibiyotik üretmeye başlar. B. subtilis rakipleriyle mücadele edebilme konusunda birçok avantaja sahiptir. On ikiden fazla çeşitlilikte antibiyotik üretebilmesi en çarpıcı özellikleri arasındadır. Bacillus subtilis antibiyotikleri, ya ribosomal olarak sentezlenen ve translasyon sonrası modifikasyon geçiren lantibiyotikler ve lantibiyotik benzeri peptidlerdir, ya da ribosomal olmayan yolak ile üretililen çok dallı halkasal peptitlerdir.B. subtilis hücreleri, gen ifadesini `hücre yoğunluğu algılama mekanizması` ile genom çapında kontrol ederek çevresel şartlara göre metabolizmasını hızlı ve etkin bir şekilde düzenler. Hücre yoğunluğunun algılama mekanizması, mikroorganizmaların `otoindukleyici` denilen bir takım sinyal molekülleri aracılığıyla, üreme ortamındaki hücrelerin ve ilgili sinyal moleküllerinin yoğunluğunu algılamak suretiyle hücredeki bütün genlerin koordineli bir şekilde kontrolünü sağlayan ve bu sayede ortam şartlarının gerektirdiği optimum metabolik akışı temin eden bir iletişim mekanizmasıdır. Bacillus subtilis, hücre yoğunluğu algılama sistemini kullanarak uygun bir şekilde bu ayarlamaları yönlendirir ve hücre popülasyonu yoğunluğundaki değişiklikler ışığında gen ekspresyonunu düzenler.Basilisin, geniş bir bakteri yelpazesi ve bazı mantarlara karşı aktif bir antibakteriyel ajan olan ve ribozomal olmayan bir mekanizma ile sentezlenen L-antikapsin ile L-alanin'den oluşan Bacillus subtilis tarafından üretilen bir dipeptid antibiyotiktir. Basilisin biyosentezinin, bacABCDEFywfG operonu ve ywfH gen ürünleri tarafından gerçekleştirildiği kısa bir süre önce keşfedilmiştir. Öncelikle, basilisin biyosentezi, Bacillus subtilis'te, ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA'nın Spo0K (Opp)'ye bağlı bir biçimde gerçekleşen, hücre yoğunluğu algılama kontrol mekanizması altında gerçekleşmektedir. Bu mekanzşmanın yanı sıra, aynı zamanda diğer global düzenleyici Spo0A ile pozitif olarak, CodY ve AbrB global düzenleyiciler ile de negatif olarak düzenlenmektedir.SinR proteini B. subtilis'in büyüme eğrisinde, geçiş fazı döneminde etki gösteren önemli düzenleyicilerden biridir. SinR, geçiş fazı döneminde kompetans ve motilite gelişimini aktive ederken sporulasyon ve ekzoproteaz üretimini engelleyerek çift fonksiyon gösteren önemli bir düzenleyicidir. SinR proteininin N-terminal bölgesi helix-turn-helix motifi içerir ve buna bağlı olarak DNA bağlanma yüzeyi oluşturur. SinR'ın fonksiyonu dikkate alındığında kompetans ve motiliteyi nasıl düzenlediği halen bilinmezken ekzoporeteaz ve sporulasyon üzerindeki negatif etkisi daha iyi anlaşılmıştır.SinR proteininin bir diğer özelliği de ComK proteininin negatif düzenlenmesinden sorumlu Rok proteininin transkripsiyonunu negatif bir şekilde etkilemesidir. Rok proteininin baskılanması ile SinR'nin ComK ekspresyonu süresindaki rolü pozitif bir şekilde düzenlenmiş olur. Aktif ComA~P, comS geni de dâhil olmak üzere birçok genin ekspresyonunu aktive eder. comS geni srfA operonunda, srfB (srfORF2) geni içinde yer alır. ComS, kompetans transkripsiyon faktörü ComK'nın ClpC (Chaperon benzeri protein) ve MecA'nın bulunduğu proteolitik kompleksten ayrılmasını sağlar ve parçalanmasını önler. Serbest kalan ComK kendi ekspresyonunu teşvik eder ve hücre içindeki konsantrasyonunu arttırır ayrıca ardından ilgili genlerin promotor bölgelerine bağlanar ve transkripsiyonlarını aktive eder. Hücre içindeki konsantrasyonu hızla artan ComK bu otoindükleyici döngü sayesinde DNA bağlanma, DNA alımı ve DNA integrasyondan sorumlu olan geç kompetans genlerini aktive eder.DegU ve DegS proteinleri kompetans gelişimde rol alan diğer önemli düzenleyicilerdir. Birlikte kompetans gelişiminin aynı sıra degredatif enzim sentezinin düzenlenmesini de sağlarlar. Fosfatlanmış DegU~P degredatif enzim üretimini artırırken, fosfatlanmamış DegU comK geninin transkripsiyonunu düzenlemek için tetikleyici bir şekilde hareket eder. ComK konsantrasyonunun artması ile de kompetans gelişimi başlar. DegU proteinine ek olarak dört farklı transkripsiyon faktörü comK promotorunun trankripsiyonunun kontrolünde doğruca etkili olur. Bu düzenleyici proteinler AbrB, CodY, Rok ve comK genin kendi ürünü olan ComK'dır. AbrB proteini comK promotor transkripsiyon başlama bölgesine bağlanarak comK promotor bölgesi ile RNA polimeraz etkileşimini engeller.Sonuç olarak, AbrB, comK'nın prematüre ekspresyonunu engel çıkarak kompetans gelişimini negatif yönde etkilemiş olur. CodY logaritmik büyüme fazında negatif regülatör olarak hareket eder ve besin yoksulluğuna adaptasyon için gerekli genlerin ekspresyonunu temin eder. CodY proteininin aktivitesi GTP ve izolösin- valin gibi dallanmış amino asitlerin kontrolü altındadır. Bakteri hücreleri besin sıkıntısı ile karşılaştıklarında, GTP'nin bağlanması ile aktif hale gelen CodY' ın GTP düzeyinin düşmesine bağlı olarak aktivitesi hızlıca kısılır Karbon kaynağına ve amino asit limitasyonuna bağlı bir şekilde gelişen `stringent response` regülasyon mekanizması aktifleşir. Bu hâl GTP'nin pppGppp ve ppGpp moleküllerine dönüşmesine yol açar. Böylece, hücre içinde (p)ppGpp toplanması veya intrasellüler GTP'nin hızlıca tükenmesi ve buna bağlı olarak da CodY'in inaktif hale dönüşmesi sağlanır. CodY proteini ComK promotörü bölgesinde, RNA prolimerazın bağlanma bölgesini istilâ ederek kompetans gelişimini baskılar. ykuW geni (rok geni adıyla tanılır) tarafından Rok proteini comK transkripsiyonunu baskılayarak kendi sentezini de baskılar. ComK konsantrasyonu arttığı zamanda ise rok ekspresyonu baskılanır.Bu çalışmada ComK ve SinR'nin bacABCDEywfG operonu ekpresyonu üzerindeki etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için, bacA lokusunda lacZ füzyonu taşıyan, B. subtilis OGU1 (bacA

Bacillus subtilis is a rhizosphere-colonizing bacteria which have the ability to stimulate plant growth and also suppressing the growth of plant-pathogenic organisms. Being non-pathogenic, easy to deal with make it the organism of choice for biological and genetic laboratory research. It can grow in different environmental conditions, in soil and on the surface of plant root. B. subtilis exhibits assortment of survival approaches such as undergoing to stationary phase due to nutritional oscillations. The moment that nutrients turn out to be reduced for optimum growth at the end of the exponential growth phase, B. subtilis cells start producing a complicated motility and chemotaxis system which facilitates looking for nutrients in the surroundings. If nutritional restrictions continue, the motile cells resort to entering the stationary phase and secreting degradative enzymes. These degradative enzymes make available nutrients to cells from alternative sources that are ordinarily unreachable. Likewise, cells initiate producing antibiotics to fight probable competitors. Extended nutritional stress ends up by the development of competence, and ultimately sporulation by which the bacterial population is capable to live in such severe environmental circumstances. Bacillus subtilis appropriately directs these adjustments utilizing quorum sensing system to regulate gene expression in light of changes in cell-population density. Bacillus subtilis has the ability to produce antibiotics either ribosomally and undergo posttranslational modification such as lantibiotics and lantibiotic-like peptides or non-ribosomally such as polypeptides.Bacilysin is a peptide non-ribosomally synthesized antibiotic composed of L-alanine in the N-Terminus and L-anticapsin in the C-Terminus. Despite its simple structure, bacilysin has an impressive antimicrobial activity against a wide range of bacteria and some fungi. Recently, in Bacillus subtilis, bacABCDEywfG operon and monocistronic gene ywfH were proven to be the basic component carrying the bacilysin biosynthetic core function.Bacilysin production is under a complicated regulatory network by which several global regulators can directly or indirectly regulate its operon in negative or positive manners such as the quorum-sensing response-regulator ComA, the transition state regulator AbrB. Moreover, the bacilysin biosynthesis is regulated by quorum sensing through ComQ/ComX, PhrC (CSF) ComP/ComA pathway and stimulation of bacABCDEF expression is tightly regulated by ComA, Spo0A, AbrB and CodY DegU proteins.Expression of ComK, the main transcriptional factor of competence, is under multiple controls of several proteins both negatively and positively such as DegU, SinR, CodY, AbrB, Rok and ComK itself in addition to quorum sensing regulation.SinR, a pleiotropic DNA binding protein, is the master regulator that governs the Gram-positive model organism Bacillus subtilis life style whether to be a free-living, planktonic lifestyle or a biofilm-forming, is essential for the late-growth processes of competence and motility and also is a repressor of sporulation and subtilisin synthesis. The activity of the transcriptional regulator SinR is regulated by its antagonists, SinI, SlrA, and SlrRIn this study, the regulatory effect of ComK and SinR on the expression of bacABCDEywfG operon were determined. For this purpose, comK mutant, sinR mutant and comK-sinR double mutant strains were constructed. Subsequently, OGU1, and its comK and sinR and comK-sinR derivatives were grown in PA medium and bac promoter-directed βgalactosidase activities were measured. Moreover, with the purpose of make known how ComK and SinR proteins effect each other's binding to bac promoter, Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) were also implemented.To sum up, the results revealed that, in Bacillus subtilis, comK and sinR genes' products affect the expression of bac operon in a positive manner by binding to the bac operon promoter in a competitive manner.