Effect of processing steps on the phenolic compounds and protein digestibility of cowpea

Abstract

Börülce, Vigna unguiculata (L.) Walpers, Leguminosae familyasına aittir ve kökeni Afrika Sahra çölünün güney bölgesine aittir. Özellikle gelişmemiş ülkelerde yaygın olarak bulunan börülce tohumları özellikle kuru olarak tüketilmektedir ve protein ve fenolik bileşikler bakımından iyi bir kaynak olduğu bilinmektedir. Fakat, besinlerin sindirimine ve biyoyararlılığına olumsuz etki oluşturan tripsin gibi anti-besinsel bileşikleri barındırması sebebiyle tüketimi sınırlıdır. Geleneksel proses basamaklarının sadece anti-besinsel bileşiklerin olumsuz etkilerini azaltmada değil, ayrıca börülcenin besinsel değerlerini arttırmada da katkı sağladığı yapılmış çalışmalarda tespit edilmiştir.Bu çalışmada, doğal yöntemlerle ve laboratuar ortamında iyileştirme çalışmalarıyla üretilmiş börülce farklı türlerinin fenolik, flavonoid, antioksidan kapasitesi ve başlıca fenolik bileşikleri ölçülmüştür. Ayrıca, farklı proses basamaklarının; protein içeriği, toplam fenolik miktarı, toplam flavonoid miktarı, antioksidan kapasite, başlıca fenolik bileşikler ve tripsin inhibitör etkisi gibi özellikler seçilmiş börülce türü üzerindeki araştırılmıştır. Daha sonra in vitro olarak mide ve bağırsak simulasyonu oluşturularak protein ve fenolik bileşiklerin sindirilebilirliği üzerine proses basamaklarının etkisi değerlendirilmiştir.Farklı börülce türlere ait sonuçlar incelendiğinde, toplam serbest fenolik bileşik miktarı 0,36 ile 1,13 mg GAE/g kuru madde arasında, bağlı toplam fenolik miktarı ise 6,05 ile 9,13 mg GAE/g kuru madde arasında değiştiği görülmüştür. Bağlı toplam fenolik miktarı her bir tür için serbest toplam fenolik bileşik miktarından yüksek çıkmıştır. Ayrıca her bir tür için, doğal yöntemlerle üretilmiş ve laboratuar ortamında iyileştirilmiş börülce örnekleri arasında toplam fenolik bileşik miktarı açısından önemli bir fark olmadığı tespit edilmiştir (p>0,05). Bu sonuç ile iyileştirme çalışmalarının değerlendirelen özellikler bakımından etkili olmadığı görülmüştür.Farklı börülce örneklerine ait toplam serbest flavonoid miktaları 0,41 ile 1,48 mg CAE/g kuru madde olduğu, bağlı flavonoid miktarları ise 2,90 ile 12,6 mg CAE/g arasında ölçülmüştür. Ayrıca her bir tür için, doğal yöntemlerle üretilmiş ve laboratuar ortamında iyileştirilmiş börülce örnekleri arasında toplam flavonoid bileşik miktarı açısından önemli bir fark olmadığı tespit edilmiştir (p>0,05).Her bir börülce çeşiti için toplam antioksidan kapasiteleri 3 farklı yöntem ile (ABTS, DPPH ve FRAP) ölçülmüş ve her bir yöntemin farklı sonuçlar verdiği gözlenmiştir. Türlere ait üretim yöntemleri karşılaştırıldığında doğal yöntemlerle üretilmiş börülcelerin daha yüksek serbest antioksidan kapasitesine sahip olduğu ölçülmüştür. Fakat istatistiksel olarak doğal yöntemle üretilmiş ile iyileştirme yöntemleriyle üretilmiş börülcelere ait antioksidan kapasiteleri arasında önemli bir fark olmadığı görülmüştür (p>0,05).Özetle, Asrat türü en yüksek toplam fenolik miktarı, toplam flavonoid miktarı, DPPH ve FRAP değerlerine sahiptir. Fakat ABTS'de en yüksek değer serbest form için TVU (25,64 μmol TE/g kuru madde) türünde, bağlı form için ise Black Eyed Peas (485,15 μmol TE/g kuru madde) türünde görülmüştür. Ayrıca, iyileştirme çalışmalarının fenolik bileşik miktarları ve antioksidan kapasite değerleri açısından yetersiz kaldığı tespit edilmiştir.İşlenmiş börülce örnek sonuçları incelendiğinde en yüksek protein içeriği (39,06 g/100g kuru madde) ham börülcede olduğu ve protein miktarının proses basamakları ile azaldığı ölçülmüştür.Toplam fenolik madde miktarları, işlenmiş börülce örnekleri arasında karşılaştırıldığında en yüksek değer fermente edilmiş börülcede (1,97 mg GAE/g kuru madde), en yüksek flavonoid madde içeriği ise pişirilmiş börülce örneğinde (1,10 mg CAE/g kuru madde) tespit edilmiştir. Bu değerler ham börülce örneği için toplam fenolik madde miktarı 0,80 mg GAE/g kuru madde iken, toplam flavonoid miktarı ise 0,69 mg CAE/g kuru maddedir.Toplam antioksidan kapasitesi ise DPPH (15,96 mg TE/g kuru madde), ABTS (32,57 μmol TE/g kuru madde), FRAP (60,61 μmol Fe II/g kuru madde) yöntemleri için en yüksek değerler fermente edilmiş börülce örneğinde görülmüştür. Bunun yanında, toplam antioksidan kapasitesinin pişirme işleminden sonra ABTS değerinde %76,29, FRAP değerinde %4,93; filizlendirme işleminden sonra ise ABTS değerinde %41,13 artış olduğu tespit edilmiştir.Fenolik ve flavonoidlere ait bileşiklerden yaygın olarak bulunan bileşikler HPLC yardımı ile tespit edildi. Luteolin ıslatma, kabuk soyma, filizlendirme ve fermentasyon aşamalarından sonra en yüksek miktarda bulundu. Vanilik asit, kafeik asit, sinapik asit, gallik asit, naringenin, p-kumarik asit, kuersetin ve kateşin miktarlarının; proses basamakları ve sindirime bağlı olarak değişim gösterdiği tespit edildi.in vitro mide ve bağırsak sindirim simülasyonu sonuçlarına göre, ham börülcedeki toplam fenolik madde miktarının %38'inin diyaliz fraksiyonuna geçtiği; kabuk ayıklama (%33), sulandırma (%25), fermentasyon (%23), pişirme (%23) ve filizlendirme (%21) basamaklarında sonra geri kazanım oranının azaldığı tespit edildi.in vitro mide ve bağırsak sindirim simülasyonunun ardından, başlangıçtaki flavonoid miktarının diyaliz fraksiyonundaki maksimum geri kazanım değeri, ham börülce örneğinde (%71) belirlendi.in vitro mide ve bağırsak sindiriminin, toplam antioksidan kapasitesi üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla DPPH, ABTS ve FRAP yöntemleri kullanıldı. Diyaliz fraksiyonlara ait DPPH sonuçları karşılaştırıldığında en düşük toplam antioksidan kapasitesi sulandırılmış (2,11 mg TE/g kuru madde) ve kabukları ayrılmış (1,74 mg TE/g kuru madde) börülcede bulunurken, en yüksek toplam antioksidan kapasitesi ham börülce örneğinde (5,87 mg TE/g kuru madde) ölçülmüştür. Diyaliz fraksiyondaki en yüksek geri kazanım oranları karşılaştırıldığında ise en yüksek değer pişirilmiş börülce örneğinde (%107) hesaplanmıştır. Diğer yandan ABTS sonuçları karşılaştırıldığında, fermentasyon prosesi diyaliz fraksyiondaki antioksidan kapasitesinde artış sağlarken (142,94 μmol/g kuru madde), diğer proses basamaklarından sonra elde edilen örnekler ile ham börülce örneği arasında istatistiksel olarak bir fark görülmemiştir (p<0,05). ABTS sonuçlarının aksine FRAP değerlerine göre, diyaliz fraksiyonun miktarında proses basamaklarıyla birlikte azalış görülmüştür, en düşük değer ise kabukları ayrılmış börülce örneğinde gözlenmiştir.Protein sindirilebilirliği her bir proses basamağı ile artış göstermiştir ve bu artış en yüksek pişirilmiş börülce örneğinde (%5) hesaplanmıştır. Bu oranı %4 ile fermente edilmiş ve kabuğu ayrılmış börülce, %3 ile filizlendirilmil börülce ve %1 ile sulandırılmış börülce örneği takip etmektedir.Tripsin inhibitör aktivitesi, ham börülce örneği ile karşılaştırıldığında, proses basamakları ile önemli düzeyde azalış göstermiştir (p<0,05). Tripsin inhibitör aktivitesi, ham börülce ile karşılaştırıldığında; sulandırma prosesinden sonra %8, filizlendirme prosesinden sonra %30 ve pişirme işleminden sonra %89 oranında azaldığı belirlenmiştir. Ayrıca, fermentasyon işleminden sonra börülce örneklerinde herhangi bir tripsin inhibitör aktivitesi tespit edilmemiştir. Fakat diğer proseslerin aksine, kabuk ayırma işleminden sonra, ham örneklere oranla tripsin inhibitör aktivitesinde %11'lik bir artış belirlenmiştir.SDS Page jel elektroforezine göre, farklı proses basamaklarından elde edilen börülce örneklerinin 21,5 kDa ile 19kDa arasında benzer bantlara sahip olduğu fakat pişirilmiş börülce örneğinde tek ana bandın (31,5 kDa) olduğu görülmüştür. Bunun yanında tripsin inhibitöre ait bantlar karşılaştırıldığında, en belirgin bant kabukları ayrılmış börülce örneğinde görülürken; bunu ham, sulandırılmış ve filizlendirilmiş börülce örnekleri takip etmiştir. Fakat fermentasyon ve pişirme işlemlerinden sonra elde edilen örneklerde tripsin inhibitör bandına denk bir bant görülmemiştir.

Cowpeas, Vigna unguiculata (L.) Walpers, belong to the family Leguminosae, originated from sub-Saharan Africa. It is known as a source of protein as well as phenolic compounds and typically have been consumed as dry seeds, which is common especially in undeveloped countries. However, the consumption is limited by presence of some antinutritional compounds such as trypsin which adversely affect the digestibility and bioavailability of nutrients. ıt has been suggested through many studies that traditional processing steps contribute not only to the reduction of the adverse effects of antinutritional compounds, but also increase the nutritional value of cowpea.In this study, in order to investigate the effect of both landrace and improved types of different varieties on the health-related constituents, the total phenolic, flavonoid, antioxidant capacity, major phenolic compounds were determined. Moreover, the effect of processing steps on total phenolic, flavonoid, antioxidant capacity, major phenolic compounds were determined for a selected cowpea variety along with simulation of in vitro gastrointestinal (GI) digestion as well as its protein content, protein digestibility and trypsin inhibitor activity were examined.The variety results showed that the free total phenolic content ranged from 0.36 to 1.13 mg GAE/g dw while the bound total phenolic content ranged from 6.05 to 9.13 mg GAE/g dw. Bound total phenolic content was higher than total phenolic content of the free forms, and this for each of the varieties. Also, there was no significant difference in free total phenolic content between landrace and improved types of each varieties (p>0.05).The total flavonoid content ranged from 0.41 to 1.48 mg CAE/g dw for the free fraction and 2.90 to 12.6 mg CAE/g dw for bound fraction in cowpea varieties. When compared free total flavonoid content between landrace and improved types of each varieties, no significant difference was observed (p>0.05).The results of the total antioxidant capacity which was measured by three different methods (ABTS, DPPH and FRAP), show different trends. When compared the types of those varieties, landraces had highest free total antioxidant capacity. On the other hand, no significant difference was observed between landrace and improved types of each varieties for antioxidant capacity (p>0.05). In briefly, Asrat had highest TPC, TFC, DPPH and FRAP values but not the highest ABTS values. Moreover, the improvement application seems to be ineffective in terms of increasing amount of phenolic compounds and antioxidative capacity.Results of processed cowpeas showed that raw cowpea had the highest protein content (39.06 g/100g dw), the protein contents were decreased with processing steps.The highest total phenolic content was found after the fermentation process (1.97 mg GAE/g dw) compared to the raw samples (0.80 mg GAE/g dw). For total flavonoidcontent, the highest value was found in cooked cowpea (1.10 mg CAE/g dw). The total antioxidant capacity was found to be the highest in fermented cowpea, ranging from 15.96 mg TE/g dw for DPPH, 32.57 μmol TE/g dw for ABTS to 60.61 μmol Fe II/g dw for FRAP. Furthermore, the increases in TAC were found after cooking and germination by 76.29% and 41.13% for ABTS, and after cooking by 4.93% for FRAP compared raw cowpea.The analyses of individual phenolic compounds in analyzed processed cowpea, belonging to phenolic acids and flavonoids. Luteolin was found in high quantities after soaking, dehulling, germination and fermentation process. Other phenolic compounds measured were vanillic acid, caffeic acid, sinapic acid, gallic acid, naringenin and p-coumaric acid, quercetin, catechin. The impact of processing on these phenolic compounds was different.Also, other phenolic compounds measured were vanillic acid, caffeic acid, sinapic acid, gallic acid, naringenin and p-coumaric acid, quercetin, catechin. The impact of processing on these phenolic compounds was different.According to the results of after in vitro gastrointestinal digestion, 38% of total phenolic content were present in the dialyzed fractions for raw cowpea while after dehulling (33%), soaking (25%), fermentation (23%), cooking (23%) and germination (21%) processes the recovery ratios were decreased. After the in vitro simulation of GI digestion, the dialyzed free flavonoid fraction represented 71% of the initial value for raw cowpea which had highest recovery. To determine the effect of in vitro gastrointestinal digestion on total antioxidant capacity, DPPH, ABTS and FRAP were used. Comparing the DPPH results, the lowest TAC of the dialyzed fractions was found in soaked (2.11 mg TE/g dw) and dehulled (1.74 mg TE/g dw) cowpea while raw sample had highest TAC of the dialyzed fraction (5.87 mg TE/g dw). After in vitro GI digestion, the highest recovery in the dialyzed fraction was measured after cooking process (107%). On the other hand, overall view of the results of ABTS, the amount of the dialyzed fraction was remained same after processing steps, except fermentation made an increase in amount of the dialyzed fraction (142.94 μmol/g dw) (p<0.05). Contrary to ABTS results, FRAP The amount of the dialyzed fraction decreased with processing steps, especially the lowest TAC was observed after dehulling.Protein digestibility was significantly increased by the process steps and the highest increase was observed in cooked cowpea (5%). On the other hand, there was a significant reduction measured in the trypsin inhibitor activity after soaking (8%), germination (30%), cooking (89%) compared to raw cowpeas (p<0.05). After fermentation, no trypsin inhibitor activity was detected. However, an increased activity of the trypsin inhibitor was observed in dehulled cowpea (11%) compared to the raw samples.According to SDS Page analysis, different process steps contained almost similar bands except cooked cowpea in the range of 21.5 kDa to 191 kDa. Moreover, when compared to bands belonging to trypsin inhibitor, the clearest band was seen in dehulled cowpea and followed by raw, soaked and germinated cowpea while there was no band equal to trypsin inhibitor in cooked cowpea and fermented cowpea.