Investigating the bioavailability and bioactivity of black carrot polyphenols in an in-vitro epithelial-endothelial co-culture model

Abstract

Polifenoller açısından zengin gıdalar ve bu gıdalardan elde edilen ürünler, sağlık açısından pek çok faydası bulunması sebebiyle tüketiciler tarafından ilgi görmektedir. Bu ilgi her geçen gün artmakta, bilimsel çalışmalar ile elde edilen veriler bu artışı desteklemektedir. Günlük diyette polifenollere yer vermenin organizmaya pek çok faydası bulunmaktadır. Nörodejeneratif hastalıklara, kansere ve kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu rol oynaması, bağışıklık sistemini güçlendirmesi ve sindirim sistemini düzenlemesi gibi özellikler bu faydalardan birkaçıdır. Polifenol içeriği bakımından önemli bir yere sahip olan siyah havuç, özellikle antosiyaninler bakımından zengindir. Siyah havuç başta Türkiye, Orta Doğu ve Uzak Doğu olmak üzere pek çok coğrafyada binlerce yıldır yetiştirilmekte ve tüketilmektedir. Taze meyve olarak tüketilmesinin yanı sıra siyah havuç suyu, konsantresi ve siyah havuçtan üretilen fermente içecekler de sıkça tüketilmektedir. Fakat polifenollerin sağlığa yararlı olabilmesi için, tüketim miktarının yanında organizmadaki biyoyararlığı da önemlidir. Taze siyah havucun yanı sıra, havuç kabuğu ve posasının da karşılaştırıldığı bu çalışmada, siyah havuç antosiyaninlerinin biyoyararlılığı ve biyoaktivitesi araştırılmıştır. Araştırmalarda canlı organizmaya en yakın sonuçlara ulaşabilmek için in-vitro hücre modeli kullanılmıştır. Taze siyah havuç, kabuk ve posa örnekleri ön soğutmalı öğütücü ile toz haline getirilmiş ve kimyasal ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Çalışmalarda hem sindirilmiş hem de sindirilmemiş örneklerine yer verilmiştir. Sindirim iki aşama şeklinde tasarlanmıştır. İlk aşamada örnekler 2 saat boyunca 10 mL mide solusyonuna maruz bırakılmış, ikinci aşamada ise ince bağırsak sindirimi, örneklerin 30 mL duodenal sıvı ve 15 mL safra sıvısı karışımı bir solusyonda 4 saat bekletilmesi ile simule edilmiştir. Organizmadaki emilimin incelendiği transport deneyleri Caco-2 hücreleri ile, çalışmanın ikinci kısmında biyoaktivitenin incelendiği deneyler ise Caco-2 – Eahy926 hücreleri ile birlikte tasarlanan hücre kültür modeli kullanılarak yürütülmüştür. Hücre kültürleri %70-80 konsantrasyona ulaşınca 1:3 – 1:5 oranlarında bölünmüş ve haftada 3 defa besiyerleri yenilenmiştir. Transport deneyleri 6 bölmeli transwell plateler kullanılarak yapılmıştır. Her bir bölmede yaklaşık 6,0x105 hücre olacak şekilde ekilen Caco-2 hücreleri kültür besiyerinde 21 gün boyunca çoğaltılmıştır. Siyah havuç, kabuk ve posa örnekleri ön deneyler sırasında transport besiyeri olarak seçilen HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) içerisinde çözdürülerek transport düzeneğine eklenmiştir. Caco-2 ve EA.hy926 hücreleriyle tasarlanan kültür modelinde çalışmanın ikinci kısmı olan biyoaktivite incelenmiştir. Bu aşamada 12 bölmelik transwell plateler kullanılmış ve hücre kültür modelinin 4. Gününde Caco-2 hücreleri siyah havuç ve ürünlerinden hazırlanan örneklere maruz bırakılmıştır. Deney öncesinde bazal kısma, kardiyovasküler hastalıklardan kaynaklanan enflamasyonun oluşturulmak üzere 1 ng mL-1 TNF-α eklenmiş ve 3 saat boyunca beklenmiştir. 4 saat süreyle 37°C'de inkübe edilen hücrelerin apical ve bazal kısımları toplanmış ve analiz edilmek üzere -80 ° C'de saklanmıştır. Deney sonuçları HPLC-DAD kullanılarak görüntülenmiştir. HPLC analizi, çalışma öncesinde örneklerden çıkarılan fenolik bileşik profili kullanılarak yapılmıştır. Caco-2 – Eahy926 hücre kültür modeli ile yapılan biyoaktivite çalışmalarında nitrik oksit (NO) ve hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) ve sitotoksisite analizleri yapılmıştır. Bunun yanında ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) testi ile siyah havuç antosiyaninlerinin antienflamatuar etkisi incelenmiştir. Yapılan tüm çalışmalar tek yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. HPLC analizlerine göre antosiyanin profilinde en yüksek oranda bulunan 5 antosiyanin başta cyanidin-3-xylosylferuloyl-glucosylgalactoside olmak üzere; cyanidin-3-xylosylglucosyl-galactoside, cyanidin-3-xylosylgalactoside, cyanidin-3-xylosylsinapoyl-glucosyl-alactoside, cyanidin-3-xylosylcoumaroyl-glucosylgalactoside şeklinde belirlenmiştir. En yüksek oranda bulunan fenolik asitlerin ise başta Klorojenik asit olmka üzere, Neoklorojenik asit ve Kafeik asit olduğu tespit edilmiştir. Edinilen sonuçlara göre, çalışmanın her iki kısmında da, sindirime uğramış örnekler sindirilmemiş örneklere göre daha iyi sonuçlar vermiştir. Transport çalışmalarında, sindirilmiş örneklerle yapılan deneylerde bazal kısımda bulunan antosiyanin konsantrasyonu başlangıç konsantrasyonunun % 1.3 – 5.3 arasında değişirken, sindirilmemiş örneklerde bu oran % 0.8 – 2.7 aralığında bulunmuştur. Benzer şekilde fenolik asitler de transport deneylerinde, sindirilmiş örneklerle çalışılan düzenekte bazal kısımda başlangıç konsantrasyonunun % 4 - 7 aralığında bulunurken, sindirilmemiş örneklerde bazal kısımda bu oran % 1.6 -3.3 aralığında bulunmuştur. Uygulamanın 24 saat sonrasında yapılan hücre içi toksisite deneylerinde, TEER değerleri başlangıç değerlerinin % 74 – 93 aralığında bulunmuş, örneklerin uygulandığı hücrelerde herhangi bir toksik etki yaratmadığı gözlenmiştir. Elde edilen bir başka bulgu, transport deneylerinde açillenmemiş antosiyaninlerin transport membranından geçme oranının açillenmiş antosiyaninlere göre daha yüksek olmasıdır. Yapılan hücre içi reaktif oksijen türleri analizinde sonuçların TNF-α varlığı ile değiştiği gözlemlenmiştir. Enflamasyon koşulları altında değilken sindirilmiş siyah havuç posası örneğinin ROS seviyesini önemli derecede artırdığı tespit edilmiştir. Fakat TNF-α uygulanmış deney düzeneğinde, sindirilmiş siyah havuç posası örneğinin inkübasyon sonrası ROS seviyesinin %20 oranında azaldığı görülmüştür. Sonuçlar değerlendirildiğinde sindirilmiş ve sindirilmemiş siyah havuç ve sindirilmiş posa örneklerinin TNF-α uygulanmış endotelyal hücrelerde oksidatif stresi azaltabildiğine ulaşılmıştır. Endotelyal hücreler tarafından sentezlenen nitrik oksit seviyesinin belirlenmesi için yapılan analizde (NO) sindirilmiş ve sindirilmemiş siyah havuç, kabuk ve posasının, nitrik oksit üretimini, enflamasyon varlığında ve yokluğunda artırdığı belirlenmiştir. Siyah havuç, kabuk ve posa örnekleri uygulanmış deney düzeneğinde, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), VEGF (vascular endothelial growth factor), IL-8 (interleukin-8) ve ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) belirteçleri kullanılarak, siyah havuç antosiyaninlerinin antienflamatuar etkisi incelenmiştir. Yapılan deneylerde TNF-α uygulanmış örneklerde belirteçler enflamasyon bulunmayan örneklere göre çok daha yüksek bulunmuştur. Sağlıklı koşullar altında IL-8 konsantrasyonunun, sindirilmiş siyah havuç örneğinin uygulandığı hücrelerde azaldığı görülmüştür. Aynı zamanda sindirilmemiş siyah havuç ve posa örneklerinde de yüksek miktarda azalma tespit edilmiştir. TNF-α aktivitesinin bulunduğu durumda IL-8, TNF-α bulunmayan hücrelere kıyasla, sindirilmiş ve sindirilmemiş kabuk ve posa örnekleri tarafından azaltılmıştır. Enflamasyon bulunmadığı durumda, VEGF salgısı hem sindirilmiş hem de sindirilmemiş siyah havuç, kabuk ve posa örnekleri tarafından azaltılmıştır. Özellikle sindirilmemiş posa ve kabuk bu belirteçte kayda değer bir fark göstermiştir. TNF-α' ya maruz bırakılmış hücrelerde VEGF salgısındaki azalma sindirilmiş ve sindirilmemiş örneklerin her ikisi için de çok daha yüksektir. MCP-1 salınımının TNF-α varlığında önemli düzeyde arttığı görülmüştür. Fakat tüm örnekler MCP-1 seviyesinin azaltılması yönünde etki etmiştir. ICAM-1 belirteci de hem sindirilmiş hem sindirilmemiş örnekler ile azalma yönünde sonuçlar vermiştir. Deneyler sonucunda siyah havuç antosiyaninlerinin enflamasyonu önleyici rol oynadığı, belirteçlerin %92 oranına varan bir azalma gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmada kullanılmak üzere tasarlanan Caco-2 – Eahy926 hücre kültür modeli, yapılan deneylerde literatürdeki çalışmalarla paralel sonuçlar vermiş, biyoyararlılık ve biyoaktivite çalışmalarında kullanılmaya uygun bulunmuştur.

It has attracted attention to consume polyphenol rich fruits and vegetables and utilise their byproducts recently. Black carrot is one of those foods that is rich in polyphenols especially in anthocyanins. These compounds have numerous health benefits to living organisms including protection to neurodegenerative diseases, cancer and cardiovascular diseases. In order to have these health benefits polphenols should be bioavailable to the organism. This study was performed to test bioavailability and bioactivity of black carrot anthocyanins. Besides raw black carrot samples, pomace and peel samples were also studied. In order to simulate absorption and bioactivity of polyphenols in black carrot, pomace and peel, in vitro cell models were used. Transport experiments were carried out with Caco-2 cells and co-culture experiments were designed with both Caco-2 and Eahy926 cell lines. Results were monitored with HPLC-DAD. In co-culture experiments nitric oxide assay (NO), intracellular reactive oxygen species assay (ROS) were used, as well as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) to evaluate the anti-inflammatory effect of black carrot anthocyanins. Both in transport and co-culture experiments, digested samples gave better results than undigested samples. In bioavailability experiments digested samples were found to have a basal recovery between 1.3 – 5.3 % of initial anthocyanin concentration whereas undigested samples were found between 0.8 – 2.7 % of initial values. A similar result was seen in transport of phenolic acids. No cytotoxic effect was observed after 24 hours prior to treatment (TEER values were found between 74-93 % of initial values after 24 hours). The anti-inflammatory effect was determined in cells treated with black carrot, pomace and peel samples by using MCP-1, VEGF, ICAM-1 and IL-8 markers. In these experiments, black carrot anthocyanins were found to have anti-inflammatory effect with decrease of these markers up to 92 %. This co-culture model was found to be applicable for bioavailability and bioactivity studies.