Gram-positive bacteria sensing in a microfluidic chip by ac electrophoresis

Abstract

Mikroakışkan sistemler, küçük ölçekli boyutlara sahip ince kanallarda akışkanların yönlendirildiği sistemdir. Biyolojiden kimyaya, optikten bilgi teknolojisine birçok farklı alanda çeşitli uygulamaların yapılmasına olanak sağlayan seçkin bir alandır. Deneylerin süresini kısaltarak daha hızlı sonuçlar elde etme, yüksek maliyetli reaktiflerin daha az kullanılmasıyla toplam maliyeti azaltma, moleküllerin ayrılmasında ve saptanmasında yüksek hassaslıkla birlikte yüksek çözünürlük sağlama ve çok küçük hacim ve boyutlarda az enerji tüketimi ile yüksek oranda akışkan kontrolünün sağlanması gibi önemli avantajlar sağlar. Kanseri ve patojenleri saptamak amacıyla diyagnostik deneylerde kullanılabilir ve kapiler elektroforez, DNA analizi, akış sitometrisi, imünolojik testler, PZR amplifikasyonu ve hücrelerin ayrılması gibi birçok farklı alanda kullanılabilir. Bu sistem çip-üstü-laboratuvar olarak da bilinir. Çip-üstü- laboratuvar araçları ve isteğe uyarlanmış elektronik birim mikroakışkan çip üzerinde dielektroforez (DEP) ve empedans (IA) yöntemlerini birleştirir. DEP, elektrokinetik kuvvetlerin alt gruplarından biridir ve düzgün olmayan elekriksel alanda yüklü ya da nötr parçacıkların elektriksel hareketi olarak tanımlanır. Bu yöntemi kullanarak çeşitli biyosensör uygulamaları için bakterinin konsantre edilmesi ve bakteri kayıplarını azaltmakla birlikte akış hızını düşürerek hızlıca mikroorganizmaların tespit edilmesine olanak sağlar. Bu yetenekler sadece bakteriler ile sınrlı olmamakla birlikte mayalar, virüsler, DNA, kanser hücreleri, kırmızı ve beyaz kan hücreleri, karbon nanotüp gibi parçacıklar ve 105 Da dan fazla kütleye sahip proteinler için de geçerlidir. Empedans ise elektrokimyasal metodlardan biridir ve parçacıkların elektriksel özelliklerine dayanır. Çip-üstü-laboratuvar araçları empedans ölçümlerini reseptörleri, enzimleri, kan hücrelerini, DNA'yı, antikorları, virüsleri, makrofajları, fibroblastları ve endotelyal hücreleri konsantre etmek ve saptamak amacıyla kullanır. Empedans tekniği kullanılarak Gram-pozitif ya da Gram-negatif birçok farklı bakteri türü tespit edilip niceliği belirlenebilir. Örneğin, Salmonella, E. coli, Listeria innocua, Staphylococcus aureus, Enterococcus faeccalis ve Listeria monocytogenes. Saptama süresi saniyelerden 1 güne kadar değişkenlik gösterebilir. Bakteri hücrelerini agar plaka üzerinde kültüre etme ve görüntüleme gibi geleneksel yöntemler en az bir gün olmakla birlikte haftalarca sürebilir. Bu yöntemlerle yapılan deneylerde, E. coli gibi hızlı büyüyen bir bakteri için analiz süresi bir-iki gün arasında değişkenlik gösterirken Mycobacteria gibi yavaş büyüyen türlerde analiz süresi birkaç hafta sürebilir. Bununla birlikte bazı bakteri türleri mikroskop altında gözlemlenebilir, fakat kültüre edilemez. Hayatı tehdit eden enfeksiyonlarda ve acil durumlarda bu analiz süresi çok uzun olacaktır ve bu kabul edilemez. Analiz süresini azaltmak amacıyla, bakteriyi konsantre etme, saptama ve tanımlama işlemleri kültüre etme ve büyüme adımları olmaksızın gerçekleştirilmelidir. Bu amaçla, bu çalışmada DEP ve IA yöntemleri kullanılmıştır. Bu yötemlerin birleştirilmesiyle hücrelerin tutulması, saptanması ve parçalanması ile birlikte DNA, RNA, mayalar, virüsler, kanserli hücreler ve bakterilerin saptanması kısa sürede gerçekleştirilmiş olacak. Bakteriler prokaryotik hücrelerdir. Bu hücreler tek halkalı DNA molekülüne sahip olmakla birlikte çekirdek ve membran-bağlı organelleri eksiktir. Bakteriler hücre zarının yapısına bağlı olarak iki gruba ayrılırlar: Gram-pozitif bakteriler ve Gram-negatif bakteriler. Gram-negatif bateriler, dış zara sahip olmakla birlikte ince bir peptidoglikan tabakasına sahiptirler. Gram-pozitif bakteriler ise dış zara sahip olmamakla birlikte kalın bir peptidoglikan yapısına sahiptir. Gram-pozitif bakteri iki farklı empedans bölgesine sahiptir; yüksek impedans bölgesi hücre zarında bulunurken alçak impedans bölgesi hücre duvarında bulunur. AC elektrik alan mikroakışkan sistemler içinde bakteri hücrelerine uygulandığında bu impedans bölgeleri arasında gidip gelir. Bununla birlikte, Gram-pozitif bakteriler hücre duvarlarında anyonik özellik gösteren teikoik asitlere sahiptir. Bu anyonic özellik AC elektrik alanını etkiler. Bu çalışmada, Gram-pozitif bakterilerden Enterococcus faecalis kullanıldı. Her bakteri farklı ve kendine has elektriksel özelliğe sahip olduğu için DEP ve IA metodlarıyla deney süresini kısaltarak çok düşük konsantrasyonlarda bile bu bakterileri konsantre etmek ve saptamak mümkün olacaktır.

Microfluidics is a study of systems which manipulate fluids in tiny channels with dimensions at microscale. It is a distinct field which provides making applications in different fields from biology and chemistry to optics and information technology. Microfluidic systems provide several advantages in these fields especially curtailing time of experiments and by this way, giving faster results, reducing whole costs because of lesser use of overpriced reagents and providing high resolution as well as sensitivity in both detection and experiments of separation of molecules, and accomplishing greater fluid control with low energy consumption under small volumes and small size. It can be utilized in a wide range of applications: In order to detect cancer and pathogens, it can be used in diagnostic experiments and utilized in different procedures like capillary electrophoresis, DNA analysis, flow cytometry, immune assays, PCR amplification and separation of cells. These systems also known as Lab-on-a-chip system. Lab-on-a-chip devices and an electronic unit, which is customized, combines DEP and IA on the microfluidic chips.Dielectrophoresis is one of the subgroups of electrokinetic force, and is described as the movement of electrically charged or neutral particles in a non-uniform electric field. By using DEP method, various capabilities are performed like concentrating, arraying, rotating and moving particles as well as biological materials. DEP is a bright field in order to concentrate bacteria by using several biosensor applications, since by using DEP, it is possible to detect microorganisms rapidly by reducing flow rates as well as reducing bacteria losses. These abilities are not just specific for bacteria but for yeasts, viruses, cancer cells, red and white blood cells, DNA, proteins with a mass of higher than 105 Da, and particles like carbon nanotubes, as well.Impedance is one of the electrochemical methods, which is based on the electrical features of particles. Lab-on-a-chip (LOC) tools utilize the impedance measurements in order to concentrate and detect receptors, enzymes, blood cells, DNA, antibodies, viruses, macrophages, fibroblasts, endothelial cells and so on. Besides, single cell impedance analysis are utilized effectively for a number of techniques like cell counting, discrimination, behavior analysis and growth of bacteria. By using the impedance technique, it is possible to detect and quantify several species of bacteria which are either gram-positive or gram-negative like Salmonella, E. coli, Listeria innocua, Staphylococcus aureus, Enterococcus faeccalis, Listeria monocytogenes and so on. Detection time vary from seconds to 1 day.Traditional methods like culturing and visualizing of bacterial cells on an array of agar plates takes time of one day to a few weeks. In order to identify bacteria by these methods, analysis time is one to two days for E. coli growing fastly, while analysis time is a few weeks for Mycobacteria species growing slowly. Besides, some species of bacteria can be viewed under the microscope; however, they are non-culturable. In the circumstances like emergency case and life-threatening infections, analysis time will be so lengthy, and this is not reasonable. So as to diminish analysis time, concentrating, detecting and identifying bacteria must be performed without culturing and growth steps. Instead of these methods, DEP and IA were utilized in this study. As a combination, utilizing the DEP and IA is very influential in order to detect DNA, RNA, yeasts, viruses, cancerous cells and bacteria as well as to trap, detect and lyse of the cells.Bacteria are prokaryotes which have single circular DNA as a genetic material but not nuclei and membrane-bound organelles. One of the classification in the bacteria is based on structure of cell envelope which is peptidoglycan thickness. In this classification, two types of bacteria are present: Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria. While Gram-negative bacteria possess thin peptidoglycan layer as well as outer cell membrane, Gram-positive bacteria possess thick peptidoglycan layer, but not outer cell membrane. There are two impedance regions found in the Gram-positive bacteria: high impedance region in cell memrane and low impedance region in the cell wall. When the AC electric field is performed on the bacterial cells within the microfluidic devices, it alternates between these impedance regions. Besides, teichoic acids found in the cell wall of Gram-positive bacteria possess the anionic characteristic property because of the presence of phosphoric acid residues. This anionic property is affected by the AC electric fiels. In this study, Enterococcus faecalis was used that belongs to the type of Gram-positive bacteria. Since each bacteria possess different and specific electrical properties, to concentrate and detect of this bacteria by the methods of DEP and IA will be effective through reducing time of experiment and analysing even if at very low concentrations.