Ölüm zamanı tayininde postmodern DNA degredasyonu: flow sitometrik analizin önemi

Abstract

55 6. ÖZET ÖLÜM ZAMANI TAYİNİNDE POSTMORTEM DNA DEGRADASYONU: FLOW SİTOMETRİK ANALİZİN ÖNEMİ Ölüm zamanının tayini daima adli tıbbın primer konularından biri olmuştur. Postmortem dönemin süresini makul ölçüde tayin etmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Postmortem soğuma eğrileri, livor mortis ve rigor mortisin derecesinden faydalanmak genellikle ilk kullanılan yöntemlerdir. Özellikle göz içi sıvısı gibi çürümeden etkilenen izole sıvılarda K, Na gibi minarellerin miktar tayini şeklinde yapılan incelemeler halen önemini korumaktadır. Bazı durumlarda, kadaverik fenomenolojinin gözlenmesi ölüm zamanı belirlenmesinde yardımcı olabilir. DNA degradasyon oranının belirlenmesi ise ölüm zamanının tayin etmede çalışılan değerli bir parametre olarak gözükmektedir. Flow sitometri, belli bir dokuyu oluşturan hücrelerdeki DNA miktarını kantite etmekte kullanılabilir. Bu çalışmamızın amacı, dalak, beyin ve karaciğer doku hücrelerinde flow sitometrik DNA degradasyon kullanarak PMİ zamanının belirlenmesi ve çevresel ısı koşullarının bu bulguları etkileyip etkilemeyeceğinin araştırılmasıdır. Bu sebeple dalak, beyin ve karaciğer hücreleri +4, +21 ve + 37°C'de olmak üzere farklı ısı koşullarında inkübe edildi. 24,48 ve 72 saat sonra DNA degradasyon oranları hesaplandı. Bu çalışmaya, ölüm nedeni bilinen 22 adli otopsi dahil edilmiştir. Malignite ve enfeksiyon tespit edilen otopsi olguları hücrelerinin anormal DNA histogramı içermesinden dolayı dışlanmıştır. Alınan tüm örnekler, steril olmayan tamponlanmış fosfat solüsyonunda (PBS) saklanmıştır. Dokular petri kabına konmuş, bir şırınga kullanılarak kıyılmış ve PBS ile dilüe edilmiştir. Son hücre süspansiyonu bir test tübüne toplanmış ve PBS ile iki kez santrifüj edilmiştir. Pellet PBS ile tekrar sulandırılmış ve hücreler Beckman Coulter Epics XL flow sitometri cihazında analiz edilmek üzere propidium iodide ile boyanmıştır. Hücreler, hücresel agregatları ve kümeleşmeleri hariç bırakmak üzere integre olmuş floresana karşılık gelen kırmızı floresan bölgesinde analiz edilmiştir. Hücre süspansiyonlarının DNA degradasyon değerleri, normal DNA içeriğini56 tanımlayan gösterge değerleri ve tamamen ya da kısmi olarak degrade olmuş DNA' ya işaret eden diğer gösterge ve her ikisinin oranlan arasındaki ilişkinin hesaplanması yoluyla elde edilmiştir. Tüm doku örneklerinde DNA degradasyon değerleri 24, 48 ve 72. saatlerde önemli derecede azalmıştır. Beklenildiği gibi 4°C'deki DNA degradasyonu, 37°C koşullarına gore çok daha stabildir. Bu sonuç ceset bulunana dek olay yeri koşullarının gözlemlenmesi açısından faydalı olabilir. Sonuç olarak, çalışmamız incelenen 3 farklı doku örneğinden beyin dokusunun en yüksek DNA degradasyon oranına sahip olduğunu göstermektedir. Bu doku. oda sıcaklığında 24 saatten sonra hızla degrade oluyor ise de, diğer ısı koşulları ile karşılaştırıldığında 37°C'deki 72. saate dek süren azalmış degradasyon özellikleri ile bazı avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, çalışmamıza alınan tüm dokular flow sitometrik metod ile postmortem intervalin araştırılması açısından, 48. saatte bir dönüm noktasına sahiptir. Flow sitometrik verilerin daha iyi anlaşılabilmesi için kısa zaman aralıklarında ölüm zamanı noktalan ve sıcaklık, kimyasal ajanlar gibi cesedi etkileyen farklı koşulların etkileri araştırılmalıdır. Otopsi örneklerindeki flow sitometrik bulgular, konvansiyonel metodlarla birlikte kullanıldığında yaygın olarak ölüm zamanının belirlenmesinde faydalı bir yöntem olabilir.

57 7. SUMMARY POSTMORTEM DNA DEGRADATION IN DETERMINATION OF THE TIME OF DEATH: SIGNIFICANCE OF FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS Determination of the time of death has always been one of the primary goals of forensic medicine. Various methods have been used to define the length of the postmortem interval with reasonable approximation. Postmortem cooling curves, livor mortis and rigor mortis values are the primer tools, in general. Also, it is important to evaluate mineral levels like K, Na affected by putrefaction in vitreous humour. In some cases, observation of cadaveric phenomenology can helpful in the attempt to determine the time of death. Recently, it has been shown that DNA molecule seems to be a valuable parameter to study to determine the time of death. Flow sitometri can be used for quantitation of cellular DNA content related tissue. The aim of this study is determine the time of postmortem interval by using flow cytometric DNA degradation in the cells of spleen, brain, and liver tissues and investigate whether the environmental temperature conditions can affect this findings. For this reason spleen, brain, and liver cells incubated with three different conditions at +4, 21 and 37 °C and DNA degradation ratios was calculated after 24, 48, and 72 hours. This study is being performed on 22 forensic autopsies with known reason of death. Because of tumor cells could have abnormal DNA histogram autopsies with malign tissues excluded from this study. All taken specimens were preserved in nonsterile phosphate buffer solution (PBS). The tissues were placed in a Petri dish, minced using by syringe, and diluted in PBS. Final cell suspension was collected in a test tube and centrifuged twice with PBS. The pellet is resuspended in PBS and cells are stained with propidium iodide for analyzing on Beckman Coulter EPICS XL model Flow sitometri. Cells were gated on peak read fluorescence versus integrated fluorescence to exclude cellular aggregates and doublets. DNA degradation values of the cell suspension taken into account were obtained by calculating the relationship between the definitive values58 of cursor describing the normal content of DNA and the other cursor indicating partially or completely degraded DNA and their ratio. DNA degradation values were significantly decreased at 24, 48, and 72 hours of all tissue samples. As expected, DNA degradation was more stable at 4 °C than 37 °C. This result may be useful in observing crime scene condition until the corpse found. As a result, our study demonstrated that brain tissue has highest DNA degradation ratio compared to other tissues although it has rapidly degradation at room temperature after 24 hours we observed that brain tissue has some advantages with decreasing degradation characteristics until 72 hours at 37 °C when compared to other temperature conditions. Taken together, all tissues included in our study had a time point at 48 hours for investigation of postmortem interval with flow cytometric method. For better understanding of flow cytometric death of time points at short intervals and effects of different conditions on corpse such as temperature and chemical agents must be investigated. Flow cytometric findings in autopsy subjects could be a helpful tool for determination of time of the death when use together with conventional methods.