Farklı kaynaklardan afinite kromatografisi ile polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, kinetik ve elektroforetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

ÖZ FARKLI KAYNAKLARDAN AFİNİTE KROMATOGRAFISI İLE POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KİNETİK VE ELEKTROFORETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Mahmut ERZENGİN Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı (Doktora Tezi / Tez Danışmanı: Doç. Dr. Oktay ARSLAN) Balıkesir, Temmuz- 2002 Bu çalışmada, enzimatik kararmaya neden olan polifenol oksidaz (PPO) enzimini saflaştırmak için yeni bir afınite jeli sentezlenmiştir. Afinite jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra ligand olarak PPO'nun inhibitörlerinden biri olan p-amino benzoik asitin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir. Enzim kaynağı olarak yer elması (Helianhtus tuberosus L.) ve dut {Morus alba L.) meyveleri kullanılmıştır. Her iki kaynaktan izole edilen PPO enzimleri sentezlenen afinite jeli ile saflaştmlmıştır. Dut ve yer elması polifenol oksidaz enzimlerine nativ ve SDS poliakril amid jel elektro forezi uygulanarak, her iki enziminde yaklaşık 65 kDA molekül ağırlıklarına sahip olduğu bulunmuştur. Katekol, 4-metil katekol ve pirogallol substratlan kullanılarak, yer elması ve dut PPO enzimlerinin aktiviteleri üzerine sıcaklık ve pH'nm etkisi araştırılmıştır. Yer elması PPO enziminin kullanılan üç farklı substratı için, optimum pH ve sıcaklıklarısırasıyla pH 5.0-8.0 ve 20-35 °C arasında değiştiği bulunmuştur. Bu değerler dut PPO enzimi için ise pH 4.5-8.0 ve 20-45 °C arasında tespit edilmiştir. Her iki kaynaktan izole edilen enzimin, çeşitli zaman aralıklarında, değişik sıcaklıklardaki ısı stabiliteleri araştırılmıştır. Sıcaklık artışının her iki enzim üzerinde denatürasyona sebep olduğu gözlenmiştir. Sıcaklığın düşürülmesi sonucunda yalnız yer elması PPO enziminde renatürasyonun gerçekleştiği görülmüştür. Dut ve yer elması PPO enzimlerinin optimum pH ve sıcaklıkta katekol, 4- metil katekol ve pirogallol substratlan için Km ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile bulunmuştur. Vmax/ Km değerlerine göre yer elması PPO enzimi için en uygun substratın katekol, dut PPO enzimi için ise pirogallol olduğu bulunmuştur. Ayrıca, her iki enziminde p-kresol ve L-tirozin üzerinde hiçbir aktivite göstermediği saptanmıştır. Dut ve yer elması PPO enzimleri üzerine PPO enziminin klasik inhibitörlerine ilaveten, ilk defa sülfanamid bileşikleride inhibitor olarak kullanılmıştır. Kullanılan bileşiklerin belirli oranlarda her iki enzimi de inhibe ettiği saptanmıştır. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Yer elması; dut; polifenol oksidaz; afınite kromatografısi; ısı inaktivasyonu; inhibisyon; optimum pH ve sıcaklık.

ABSTRACT PURIFICATION OF POLYPHENOL OXIDASE FROM DIFFERENT SOURCES BY AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND INVESTIGATION OF ITS KINETIC AND ELECTROPHORETIC PROPERTIES Mahmut ERZENGİN Balıkesir University, Institute of Science, Department of Chemistry (Ph. D. Thesis / Supervisor: Doç.Dr. Oktay ARSLAN) Balıkesir, July- 2002 In this study, a new affinity gel is synthesized for the purification of polyphenol oxidase (PPO) which leads to undesirable enzymatic browning in food industry. The affinity gel is prepared by coupling L-tirozin to Sepharose- 4B by CNBr activation method and than p-amino benzoic acid, which is one of the inhibitor of polyphenol oxidase, is coupled to L-tirozin as a ligand. Jerusalem artichoke (Helianhtus tuberosus L.) and mulberry (Moras alba L.) fruits are used as enzyme sources. Polyphenol oxidases from Jerusalem artichoke and mulberry were purified by affinity chromatography. The purified enzymes were migrated as a single band on native and SDS-PAGE. The molecular weight of the both purified enzymes were estimated to be 65 kDa. Optimum PPO activity as a function of pH and temperature was determined using catechol, 4-methyl catechol and pyrogallol as substrates. The optimum pH and temperature values of jeruselam artichoke PPO for the used three substrates ranged 111between the pH 5.0-8.0 and 20-35 °C. In the case of mulberry PPO, pH 4.5-8.0 and 20-45 °C values were obtained. The termal stability of the purified enzymes at different temperatures were tested for various period of time. At the end of the each incubation period the PPO activity was determined. Increasing of the temperature lead to considerable thermal denaturation of both PPO. After lowering of temperature, renaturation was observed only for PPO of Jerusalem artichoke. At the optimum pH and temperature, the Km and Vmax values of jeruselam artichoke and mulberry PPO towards catechol, 4-methylcatechol and pyrogallol were determined by Lineweaver Burk method. The values Vmax/KM showed that jeruselam artichoke has the greatest reactivity towards catechol and mulberry has the greatest reactivity towards pyrogallol among the substrates used. On the other hand, jeruselam artichoke and mulberry PPO showed no activity toward the monophenols, p-kresol and L-tyrosine, suggesting the absence of monophenolase (cresolase) activity. Beside the classical PPO inhibitors, for the first time the inhibitory effect of some sulfanamid compounds on the jeruselam artichoke and mulberry PPO activities were also tested. Sulfanamid compounds exibited considerable inhibition on both PPO enzymes. KEY WORDS: Jeruselam artichoke; mulberry; polyphenol oxidase; affinity chromatography; heat inactivation; inhibition; optimum pH and temperature. IV