Eritrositlerden karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi ve uygulanması

Abstract

ÖZ ERİTROSİTLERDEN KARBONİK ANHİDRAZ İZOENZİMLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN YENİ BİR AFİNİTE JELİNİN SENTEZİ VE UYGULANMASI Özen ÖZENSOY Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı (Yüksek Lisans Tezi / Tez Danışmanı : Doç. Dr. Oktay ARSLAN) Balıkesir, 2002 Karbonik anhidraz (E.C 4.2.1.1), CO2 hidratasyon ve HCO3* dehidratasyon reaksiyonlarım katalizleyen, çinko İyonu içeren bir metaloenzimdir. Bu çalışmada, karbonik anhidraz (CA) izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jeli sentezlenmiştir. Afînite jeli sentezinde matriks olarak, oksiran grupları içeren metakrilamid ve N,N'-bis-metilen-(metakrilamid) monomerlerinin bir kopolimeri olan Eupergit C-250 L kullanılmıştır. Eupergit C-250 L matriksinin içerdiği oksiran grupları, ılıman şartlarda ligandın bağlanmasını sağlarken, aynı zamanda bir uzantı kolu olarak fonksiyon göstermektedir. Ligand olarak, karbonik anhidraz enziminin kompetetif bir inbibitörü olan p-aminobenzensülfonamid kullanılmıştır. Sentezlenen Eupergit C-250 L-sülfonamid kimyasal yapısına sahip afinite jeli kullanılarak, sığır eritrosit karbonik anhidraz (BCA), insan eritrosit karbonik anhidraz I ve II (HCA-I, HCA-II) izoenzimleri direkt hemolizattan saflaştırılmıştır.Afinite jetinin enzimi bağlama kapasitesi, her bir izoenzim için farklı sıcaklık, pH ve iyonik şiddetlerde belirlenmiştir. Maksimum bağlanma, 5°C, pH 7.0 ve 0.6 iyonik şiddette gerçekleştirilmiştir. Kolonda tutunan CA izoenziminin elüsyonu için, farklı çözeltiler kullanılmış ve en uygun elüsyon tamponlarının BCA ve HCA-II izoenzimleri için, 0.1 M NaCH3COO / 0.5 M NaC104 (pH 5.6), HCA-I izoenzimi için, 1 M NaCl /25 mM Na2HPC>4 (pH 6.3) olarak belirlenmiştir. BCA ve HCA izoenzimlerinin sırasıyla en yüksek saflaştınlma dereceleri, 478 ve 258 şeklinde tespit edilmiştir. Afinite jeli ile saflaştırılan izoenzimlerin saflığı, SDS-poliakrilamid jel elektroforeziyle kontrol edilmiştir. ANAHTAR SÖZCÜKLER: karbonik anhidraz / izoenzim / afinite kromatografi / Eupergit C-250 L

ABSTRACT APPLICATION AND SYNTHESIS OF A NEW AFFINITY GEL FOR THE PURIFICATION OF CARBONIC ANHYDRASE ISOZYMES FROM THE ERYTHROCYTES Özen ÖZENSOY Balıkesir University, Institute of Science, Department of Chemistry (MSc Thesis / Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Oktay ARSLAN) Balıkesir-Turkey, 2002 The carbonic anhydrase enzyme (E.C. 4.2.1.1), is a zinc-containing metaloenzyme that catalyses the reversible hydration of CO2 and dehydration of HCO3` reactions. In this study, a new affinity gel has been synthesized to purify carbonic anhydrase (CA) isozymes from the erythrocytes. Eupergit C-250 L, which is a copolymer of methacrylamide and N,N'-methylene-bis-(methacrylamide) monomers containing oxirane groups, has been used as a matrix in the affinity gel synthesis. The reactive oxirane groups that Eupergit C-250 L contains, provide the binding of the ligand to the matrix in mild conditions. At the same time, the oxirane groups serves as a spacer-arm. The p-aminobenzensulfonamide, which is a competetive inhibitor of carbonic anhydrase, has been used as a ligand. Bovine erythrocyte carbonic anhydrase (BCA), human erythrocyte carbonic anhydrase I and II (HCA-I and HCA-II) isozymes have been purified from the hemolysate, directly by using the affinity gel, which has a chemical structure of Eupergit C-250 L-sulfonamide.The binding capacities of the affinity gel have been determined at different temperatures, pH's, and ionic strengths for each isozyme of CA. Maximum binding was achieved at 5°C, pH 7.0, and 0.6 ionic strength. Different solutions were used for the CA elution which is adsorbed on the column and the most suitable elution buffers have been determined as, 0.1 M NaCH3COO / 0.5 M NaC104 (pH 5.6) for BCA and HCA-II isozymes and 1 M NaCl / 25 mM Na2HP04 (pH 6.3) for HCA-I isozyme. The greatest purification degree of BCA and HCA (I and II) have been obtained as 478 and 258 folds, respectively. The purification of BCA, HCA-I and HCA-II isozymes has been controlled by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. KEY WORDS: carbonic anhydrase / isozymes / affinity chromatography / Eupergit C-250 L IV