Characterization and antimicrobial properties of multiple layer silk fibroin/hyaluronic acid film on cocrmo alloy

Abstract

Bu çalışma, CoCrMo alaşımları üzerinde çoklu tabakalı ipek fibroin (SF) ve hyaluronik asit (HA) filmlerinin pH'a bağlı olarak kompleks oluşturmasının karakterize edilmesini ve bu filmlerin antimikrobiyal özelliklerinin incelenmesini amaçlamıştır.Mevcut çalışmada, CoCrMo alaşımları üzerinde altı, on ve on dört tabakadan oluşan SF, SF/HA kompleks ve SF/HA tabaka-tabaka (LBL) olarak adlandırılan üç çeşit film kaplanmıştır. Literatürde, toplam biyopolimer konsantrasyonu, karışım sırası ve biyopolimer oranı dikkate alınmaksızın, SF ve HA kompleksinin pH 2.5-3.5 aralığında oluştuğu bilinmektedir. CoCrMo alaşımları üzerindeki filmlerin morfolojisine/özelliklerine pH'ın etkisini incelemek için, üç farklı pH değerleri seçilmiştir: 3.0, 3.5 ve 5.5. Filmlerin yüzey yapıları Fourier Dönüşümlü Toplam Yansıması Azaltılmış İnfrared Spektroskopisi (ATR-FTIR) ve X-Işınları Kırınımı (XRD) ile incelenmiş ve filmlerin morfolojileri Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskopu (AFM) ile araştırılmıştır. Bütün örnekler methanol ile muamele edilmiştir, mekanik özellikleri arttırmak ve filmleri çözünmez hale getirmek için konformasyon dönüşümününün ipek I'den ipek II'ye uyarılması amaçlanmıştır. pH 3.0, 3.5 ve 5.5'te bütün örnekler için, ipek I ve ipek II yapılarının karakteristik IR absorpsiyon pikleri ATR-FTIR spektroskopisi ile gözlenmiştir. pH 3.5'te CoCrMo alaşımı üzerindeki on dört tabakalı SF/HA kompleks ve SF/HA tabaka-tabaka filmlerinin XRD spektraları, inorganik faz nedeniyle filmlerin amorf yapıda olduklarını göstermiştir. SEM görüntüleri, pH 3.0 ve 3.5'te, çalışma pH'ının fibroinin izoelektrik noktasına (IEP=3.9) yaklaştıkça, SF molekülerinin daha çok bir arada toparlanma eğiliminde olduklarını göstermiştir. Ancak pH 5.5'te, SF fiberleri, çalışılan pH'ın fibroinin izolektrik noktasından uzak olması nedeniyle yüzeyin her yerine ilerlemiştir. SEM görüntülerinde görüldüğü gibi, AFM görüntülerinde de pH 3.5'te, kolloidal parçacıklar çözelti çalışma pH'ının fibroinin izoelektrik noktasına yakın olması nedeniyle gözlenmiştir. Aynı zamanda AFM görüntüleri, LBL kaplı örneklerin film kalınlığının ve yüzey pürüzlülüğünün incelenen kompleks kaplı film örneklerinden hemen hemen daha yüksek olduğunu göstermiştir. Levofloksasin olarak adlandırılan antibiyotik, film özelliklerini arttırmak için on dört kaplı SF/HA kompleks ve SF/HA tabaka-tabaka filmlere yüklenmiştir. pH 3.5'te CoCrMo alaşımları üzerindeki bu antibiyotik yüklü filmler, ATR-FTIR spektroskopisi ve SEM ile incelenmiştir. Karakteristik IR absorbsiyon bandları ATR-FTIR spektroskopisi ile gözlenmiştir. Antibiyotik yüklü olmayan filmler ile kıyaslandığında, SEM görüntülerinde levofloksasin yüklü örneklerin yüzeyi daha düz ve daha eşdağılımlı yapı göstermiştir. pH 3.5'te, CoCrMo alaşımı üzerindeki on dört tabakalı SF/HA kompleks ve SF/HA tabaka-tabaka filmlerinin antimikrobiyal özellikleri koloni sayma methodu ile incelenmiştir. Antibiyotik yüklü örnekler, diğer örnekler ile kıyaslandığında daha az bakteri tutunumu göstermişlerdir. Sonuç olarak, antibiyotik yükleme bakteri tutunumunu azaltmak için etkili bir yoldur ve bu yöntem enfeksiyon risklerini indirgeyecektir.

This research aimed to characterize the pH-induced complexation of multiple layer silk fibroin (SF) and hyaluronic acid (HA) films on CoCrMo alloys and investigate the antimicrobial properties of these films. In the present study, consisted of six, ten and fourteen layers of three type films which are called SF, SF/HA complex and SF/HA layer-by-layer (LBL) were coated on CoCrMo alloys. In the literature, it was known that SF and HA complexes were occurred within the pH-range of 2.5-3.5, disregarding of the biopolymer ratio, mixing order and total biopolymer concentration. To investigate the effect of pH on the morphology/properties of the films on CoCrMo alloys, three different pH values were chosen: 3.0, 3.5 and 5.5. Surface structures of films were investigated by Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) and X-Ray Diffraction (XRD) and morphology of films were searched by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Atomic Force Microscopy (AFM). All samples were treated with methanol, a conformation transition was aimed to stimulate from silk I to silk II to make the films insoluble and to increase the mechanical characteristics. Characteristic IR absorption peaks for silk I and silk II structures were observed by ATR-FTIR spectroscopy for all samples at pH 3.0, 3.5 and 5.5. The XRD spectra of fourteen layer of SF/HA complex and SF/HA layer-by-layer films on CoCrMo alloys at pH 3.5 showed that the films are amorphous structure due to the inorganic phase. SEM images showed that at pH 3.0 and 3.5, as the working pH values close to the isoelectric point of fibroin (IEP=3.9), SF molecules tend to more aggregate. However, at pH 5.5, the fibres of SF are moved everywhere of the surface due to the working pH which is far away to the IEP of fibroin. As is seen for SEM images, at pH 3.5, colloidal particles are observed for all multilayer SF/HA complex and SF/HA layer-by-layer films on CoCrMo alloys due to the working solution pH close to IEP of fibroin in AFM images. AFM images also clearly indicated that the film thickness and surface roughness of LBL coated specimens is almost higher than those of complex coated films on the investigated specimens.Antibiotic called levofloxacin was loaded into the fourteen layer of SF/HA complex and SF/HA layer-by-layer films to enhance the film properties. These antibiotic loaded films on CoCrMo alloys at pH 3.5 were investigated by ATR-FTIR spectroscopy and SEM. Characteristic IR absorptions bands were observed by ATR-FTIR spectroscopy. Compared to the without antibiotic loaded films, the surface of the levofloxacin loaded samples showed smoother and more uniform structure in SEM images.Antimicrobial properties of the fourteen layer of SF/HA complex and SF/HA layer-by-layer films on CoCrMo alloys at pH 3.5 were investigated by colony counting method. Antibiotic loaded samples showed lower bacterial attachment as compared to the other samples. In conclusion, antibiotic loading is an efficient way to reduce the bacterial attachment and this will probably reduce the infection risks.